miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控的研究.pdf

1、miRNA廣泛在哺乳動物卵巢中表達(dá)，對卵泡的生長發(fā)育和卵巢的功能具有關(guān)鍵調(diào)控作用。眾多研究表明，miR-101與miR-144調(diào)控多種細(xì)胞的生長、分化和凋亡。但是目前尚未有miR-101與miR-144調(diào)控奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的研究。本研究以關(guān)中奶山羊?yàn)檠芯繉ο?，采用生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建等方法驗(yàn)證miR-101與miR-144的靶基因;采用RT-qPCR、Western blot檢測技術(shù)研究miR-101與miR-144

2、對靶基因TGIF1的調(diào)控作用;采用流式細(xì)胞術(shù)等方法研究miR-101與miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用機(jī)制;以期闡明miR-101與miR-144調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制，為提高奶山羊產(chǎn)羔率提供試驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中，驗(yàn)證miR-101、miR-144與TGIF1基因的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系
　　(1)利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了TGIF1基因3'UTR區(qū)含有miR-101和miR-144

3、的靶位點(diǎn)。構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體，分別將miR-101和miR-144的模擬物以及Negativecontrol(NC)與TGIF1-3'UTR區(qū)雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明，與NC組相比，miR-101和miR-144分別顯著抑制熒光素酶活性。而將NC、miR-101和miR-144的模擬物與突變載體共轉(zhuǎn)染，檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-101和miR-144對突變載體的熒光

4、素酶活性沒有顯著影響。據(jù)此初步鑒定TGIF1基因?yàn)閙iR-101和miR-144的靶基因。
　　(2)采用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測miR-101和miR-144對靶基因TGIF1的表達(dá)調(diào)控，同時檢測TGIF1基因在山羊組織中的表達(dá)情況。分別將NC、miR-101和miR-144的模擬物以及抑制劑轉(zhuǎn)染至奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-101和miR-144分別顯著下調(diào)靶基因TGIF1在m

5、RNA和蛋白水平上的表達(dá);而轉(zhuǎn)染miR-101和miR-144的抑制劑之后，顯著上調(diào)TGIF1基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)。同時根據(jù)RT-qPCR的檢測結(jié)果，顯示在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中，TGIF1基因的表達(dá)相對較高。
　　2、研究miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用機(jī)制
　　(1)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，與NC組相比，過表

6、達(dá)miR-101與miR-144使顆粒細(xì)胞的凋亡率顯著升高。
　　(2)采用Western blot技術(shù)檢測Bcl-2、Bax和p53等凋亡基因的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，與NC組相比，miR-101和miR-144顯著下調(diào)Bcl-2和Bax凋亡基因的蛋白表達(dá)，顯著降低Bcl-2/Bax的蛋白比值;與NC組相比，miR-101和miR-144顯著上調(diào)p53磷酸化水平。
　　以上結(jié)果表明，TGIF1基因在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中的