Survivin在GM-CSF-G-CSF誘導(dǎo)的抗中性粒細胞凋亡中的作用.pdf

1、中性粒細胞是外周血循環(huán)和免疫系統(tǒng)中最豐富的白細胞，它具有很短的半衰期，很快經(jīng)歷自發(fā)性凋亡以利于正常細胞的周轉(zhuǎn)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimlating factor，GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimlating factor，G-CSF)是造血系統(tǒng)中重要的炎性細胞因子，它們能夠促進造血干細胞的增殖、分化

2、，并能促進中性粒細胞的成熟。它們均能夠通過延遲細胞凋亡而促進中性粒細胞的存活、從而增強中性粒細胞的功能。已有研究表明上述炎性細胞因子的抗中性粒細胞凋亡作用與Bcl-2蛋白家族成員，如Mcl-1，Al，和Bax等，以及凋亡蛋白抑制劑(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族成員，如cIAP-2的表達調(diào)控有關(guān)。然而具體的機制仍不十分清楚。 Survivin是一種新近發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)獨特的IAPs成員。

3、到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)人類survivin存在5種不同的剪接異構(gòu)體。它們似乎具有獨特的亞細胞定位和不同的凋亡調(diào)節(jié)功能。大量的研究顯示，survivin在絕大多數(shù)人類腫瘤細胞中異常高表達，而且與病人不良的預(yù)后和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，已有的針對survivin的反義核酸、RNA干擾、負顯性突變等研究取得了一定的抗腫瘤治療效果。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，survivin在正常成人細胞中也有表達，可能參與正常細胞的增殖與存活。最近發(fā)現(xiàn)，survivin在從

4、囊性纖維化病人分離得到的終末分化的中性粒細胞中有較高的表達。此研究還發(fā)現(xiàn)，survivin在正常中性粒細胞中的表達能夠被GM-CSF和G-CSF所誘導(dǎo)，并且應(yīng)用反義寡核苷酸打靶中性粒細胞的survivin，能夠取消細胞因子的抗凋亡作用。這些結(jié)果表明，survivin在中性粒細胞中可能以未知的機制參與細胞因子的細胞保護作用。本試驗欲研究凋亡蛋白抑制劑家族成員survivin在GM-CSF/G-CSF誘導(dǎo)的抗中性粒細胞凋亡中所發(fā)揮的作用及相

5、關(guān)的機制，從而為人們進一步研究中性粒細胞凋亡的調(diào)控提供新的實驗依據(jù)和理論參考。 方法： 在本實驗中，我們分別應(yīng)用了人類早幼粒白血病細胞株HL60以及新鮮分離的正常人外周血中性粒細胞。對于HL60細胞，我們分別應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)和佛波酯(PMA)進行中性粒細胞和單核細胞的分化誘導(dǎo)。根據(jù)需要給予誘導(dǎo)分化的HL60細胞以及正常的中性粒細胞一定濃度的GM-CSF或G-CSF處理。Survivin mRNA在不同細胞的表

6、達水平，通過實時定量PCR SYBR Green法來檢測；Survivin蛋白質(zhì)的表達，應(yīng)用多克隆兔抗人survivin抗體通過Western Blotting法來檢測；此外，我們還應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色、流式細胞術(shù)分析中性粒細胞的凋亡情況。最后，我們應(yīng)用雙脫氧末端終止測序法對HL60細胞和正常人中性粒細胞表達的survivin異構(gòu)體的序列進行了測定。 結(jié)果： 隨著ATRA和PMA的誘導(dǎo)分化，HL60

7、細胞中survivin mRNA的表達水平明顯降低。在誘導(dǎo)分化的第4天，survivin mRNA的水平均降低至不到原先水平的1％。相應(yīng)地，原先高表達的survivin蛋白，在誘導(dǎo)分化第4天時變得檢測不到。在ATRA誘導(dǎo)HL60細胞分化過程中，給予10 ng/mL的GM-CSF處理，survivin的表達水平與未處理組相比明顯增加。對于已分化的中性粒細胞樣HL60細胞，GM-CSF能重新誘導(dǎo)survivin的表達，并且此作用具有時間和劑

8、量的依賴性，在1ng/mL的GM-CSF處理24小時的時間點上，獲得最高的survivin表達。與此不同的是GM-CSF未能增加PMA誘導(dǎo)分化過程中HL60細胞survivin的表達。然而與HL60細胞不同，終末分化的正常人中性粒細胞，在無細胞因子培養(yǎng)24小時的條件下，survivin mRNA的水平自發(fā)性增加了6倍。而10 ng/mL，50 ng/mL的GM-CSF和25 ng/mL的G-CSF未能引起survivin mRNA水平的

9、進一步增加。無細胞因子處理組與細胞因子處理組之間survivin mRNA的表達水平無顯著性差異。雖然沒能誘導(dǎo)survivin的表達，GM-CSF/G-CSF仍然發(fā)揮著抗中性粒細胞凋亡的作用。在培養(yǎng)了6小時和24小時的中性粒細胞中，GM-CSF/G-CSF能夠分別減少凋亡細胞比例5％～10％和15％～20％。進一步對HL60細胞和中性粒細胞表達的survivin異構(gòu)體序列的測定顯示，HL60細胞表達野生型stlrvivin，而中性粒細胞

10、表達具有促凋亡潛能的survivin-2α異構(gòu)體。 結(jié)論： 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SUrVivin的表達隨著HL60細胞的分化而減少。在ATRA誘導(dǎo)分化的中性粒細胞樣HL60細胞中，survivin的表達能夠被GM-CSF誘導(dǎo)增加。然而GM-CSF對單核細胞樣分化的HL60細胞無誘導(dǎo)作用。GM-CSF/G-CSF不能誘導(dǎo)正常終末分化的中性粒細胞表達survivin。HL60細胞與中性粒細胞所表達的survivin剪接異構(gòu)體