STAT1在G-CSF誘導異基因造血干細胞移植供者T細胞免疫耐受中的作用.pdf

1、目的：臨床實踐表明應用G-CSF作為干細胞動員劑進行的外周血造血干細胞移植，其急性移植物抗宿主反應并不比傳統(tǒng)的骨髓移植高。這說明G-CSF存在著誘導免疫耐受的作用。G-CSF可以從T細胞分化、樹突狀細胞（DCs）、單個核細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等角度對干細胞移植物的免疫功能進行調(diào)節(jié)，誘導移植物中的T細胞產(chǎn)生免疫耐受。目前的觀察表明，G-CSF刺激后，出現(xiàn)Th1型細胞因子（IFN-γ、IL-2、T-bet、IL-12等）明顯減少，而Th2型細胞

2、因子（IL-10、IL-4、GATA-3等）顯著增多，這一現(xiàn)象在誘導免疫耐受中起著至關重要的作用。但是，目前對T細胞上是否存在G-CSF受體仍存在很大的爭議，因此G-CSF能否直接對T細胞產(chǎn)生作用仍不肯定。JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑作為機體內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，在機體免疫功能的形成與發(fā)揮作用中有重要的作用。這一途徑參與體內(nèi)多種病理生理過程，調(diào)節(jié)體內(nèi)眾多基因的表達，約有50余種細胞因子通過其進行信號傳導。因此，它對機體各種生理功

3、能的維持及對外界刺激做出正確的反應是非常重要的一環(huán)。其中，STAT1作為Th1型細胞因子重要的信號轉(zhuǎn)導因子，在IFN-γ、IL-2引起的基因轉(zhuǎn)錄過程中居于核心地位。并且很多學者已經(jīng)證實STAT1是GVHD重要的調(diào)控點。但到目前為止，尚沒有研究對STAT1在G-CSF誘導的免疫耐受中的變化進行過檢測。因此本實驗在G-CSF誘導免疫耐受過程中，檢測Th1型細胞及Th2型細胞的數(shù)量及比值，并檢測G-CSF受體、T-bet、GATA-3和STA

4、T1的表達水平的變化，并對其作用進行初步探討，以進一步加深對G-CSF誘導免疫耐受機制的了解、為對其進行調(diào)控打下基礎。
　　 方法：
　　 1.收集標本：分別留取23位骨髓移植供者應用G-CSF動員前及應用G-CSF動員3天后的外周血標本10ml，使用肝素抗凝。
　　 2.分組：共分為兩組，即供者應用G-CSF動員前的外周血標本和供者應用G-CSF動員后的外周血標本，為配對標本。
　　 3.應用免疫磁珠分

5、選法分選CD4+T細胞：從采集的外周血標本分離出單個核細胞后，再應用免疫磁珠分選的方法分離CD4+T細胞并提純，最后用流式細胞儀檢測CD4+T細胞的純度并計數(shù)。
　　 4.流式細胞技術檢測G-CSF動員前及G-CSF動員后的CD4+T細胞中Th1、Th2的數(shù)量及Th1/Th2比值。
　　 5.制備cDNA：把分選得來的CD4+T細胞應用Trizol試劑盒提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
　　 6.應用實時熒光定量

6、聚合酶鏈反應（Real-time Ouantitative PCR，RQ-PCR）方法分別檢測體內(nèi)應用G-CSF動員前后G-CSFR、T-bet、GATA-3和STAT1表達量的變化。
　　 7.將純化的CD4+T細胞進行細胞培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中加入不同濃度的G-CSF刺激，觀察其刺激T細胞增殖的作用。
　　 8.分別將應用G-CSF刺激前后培養(yǎng)的CD4+T細胞收集，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.
　　 9.RQ

7、-PCR方法檢測體外培養(yǎng)的CD4+T細胞經(jīng)G-CSF刺激前后的G-CSFR、T-bet、GATAT-3和STAT1表達量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.在流式細胞術檢測CD4+T細胞Th1/Th2比值結(jié)果顯示G-動員后的Th1/Th2比值較動員前的Th1/Th2比值有顯著的降低。
　　 2.我們對標本進行CD4+T細胞計數(shù)，顯示G-CSF動員3天后CD4+T細胞的數(shù)量和占單個核細胞的比例均增加。
　　 3

8、.應用RQ-PCR檢測體內(nèi)應用G-CSF動員后G-CSFR、T-bet、GATA-3及STAT1表達水平的變化。結(jié)果顯示：雖這些基因的表達均有變化，但經(jīng)統(tǒng)計學處理，均沒有統(tǒng)計學意義。
　　 4.體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細胞，結(jié)果顯示：G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細胞增殖，這種作用達峰時間為12-24小時，48小時后開始下降，72小時后作用消失。G-CSF的刺激濃度以200ng/ml為宜，增加濃度，增殖指數(shù)未見

9、明顯的增加。
　　 5.RQ-PCR檢測在體外培養(yǎng)時加入G-CSF刺激前后的CD4+T細胞的G-CSFR、T-bet、GATA-3、STAT1的表達變化。結(jié)果顯示：在體外加入G-CSF刺激后，CD4+T細胞出現(xiàn)了G-CSFR和GATA-3表達的升高，T-bet和STAT1則出現(xiàn)下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.體內(nèi)應用G-CSF動員后，Th1/Th2比值比動員前顯著降低（P<0.01）。表明在供者體內(nèi)T淋巴細胞受到

10、G-CSF刺激后，
　　 CD4+T淋巴細胞會向Th2方向分化，這可能誘導了免疫耐受的產(chǎn)生。
　　 2.體內(nèi)應用G-CSF動員后，CD4+T細胞短期內(nèi)（至少3天內(nèi)）可以因G-CSF的刺激作用而出現(xiàn)增殖。
　　 3.體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細胞時加入G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細胞增殖。這種作用12-24小時達到高峰，48小時后開始下降，72小時后消失。G-CSF最適刺激濃度以200n/ml。<

11、br>　　 4.體內(nèi)應用G-CSF動員后G-CSFR的表達量未見增高，而在外培養(yǎng)CD4+T細胞并加入G-CSF刺激后會出現(xiàn)G-CSFR表達的增高，這可能與體內(nèi)、外環(huán)境的差異，以及體內(nèi)G-CSF濃度處于較低水平且濃度不穩(wěn)定有關。
　　 5.體內(nèi)應用G-CSF動員后GATA-3及T-bet的變化趨勢不明顯。而在體外培養(yǎng)應用G-CSF后GATA-3出現(xiàn)明顯的升高同時T-bet則明顯降低，這可能與體內(nèi)外的環(huán)境差異有關。