SOX8在非小細(xì)胞型肺癌中的表達(dá)及miRNA-124治療作用的研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 SOX8在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床病理學(xué)研究
　　目的：
　　運(yùn)用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)SOX8基因在80例NSCLC病理樣本中蛋白質(zhì)和mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行研究，并對(duì)SOX8蛋白質(zhì)表達(dá)與相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。同時(shí)，為明確SOX8對(duì)于NSCLC患者預(yù)后的指導(dǎo)意義，我們對(duì)其中的77例患者進(jìn)行了隨訪。
　　方法：
　　1.應(yīng)用

2、免疫組織化學(xué)檢測(cè)NSCLC組織80例及正常支氣管肺組織7例（距原發(fā)肺癌組織邊緣＞5cm）中SOX8在翻譯水平上蛋白質(zhì)的表達(dá)。同時(shí)對(duì)SOX8蛋白質(zhì)與NSCLC包括患者年齡、性別、NSCLC細(xì)胞分化狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分級(jí)等臨床病理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)對(duì)NSCLC組織和正常支氣管肺組織中SOX8在轉(zhuǎn)錄水平上mRNA的表達(dá)。
　　3.對(duì)隨訪資料齊全的77名NSCLC患者進(jìn)行

3、隨訪，并根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果將患者分為SOX8過度表達(dá)組和SOX8低表達(dá)組，并對(duì)SOX8表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響進(jìn)行單因素生存分析（Log-rank分析）。
　　結(jié)果：
　　1.SOX8蛋白質(zhì)在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)
　　在翻譯水平上通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，正常肺組織中沒有發(fā)現(xiàn)SOX8蛋白質(zhì)的表達(dá)，而在NSCLC中有過度表達(dá)（P＜0.01）。SOX8以細(xì)胞核著色為主，僅有散在的細(xì)胞質(zhì)著色。其中，NSCLC中

4、SOX8總陽性（率）為86.25％(69/80)，而強(qiáng)表達(dá)數(shù)占62.5％(50/80)。
　　2.SOX8表達(dá)與NSCLC與臨床病理因子之間的關(guān)系
　　為進(jìn)一步探討SOX8表達(dá)在NSCLC上的意義，我們分析了SOX8與患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系（表1-1）。結(jié)果顯示，SOX8的表達(dá)程度與腫瘤體積(P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、不同分化程度（P=0.015）和臨床分級(jí)（P=0.013）相關(guān)。與之相反，SOX8

5、基因與組織分型、性別和飲酒/吸煙史無關(guān)。同時(shí)，年齡對(duì)SOX8基因的表達(dá)也無影響。
　　3.SOX8在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的mRNA表達(dá)
　　為研究SOX8在NSCLC組織和正常肺組織中轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，我們采取qRT-PCR方法進(jìn)行。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上通過qRT-PCR檢測(cè)，單因素方差分析結(jié)合Tukey's post hoc檢驗(yàn)顯示，中低分化NSCLC（11.71倍， P＜0.001）和高分化NSCLC（6.5

6、2倍， P=0.047）中SOX8基因的表達(dá)顯著高于正常支氣管肺組織。同時(shí)中低分化NSCLC中SOX8基因的表達(dá)顯著高于高分化NSCLC(1.80倍，P＜0.001)。
　　4.SOX8蛋白質(zhì)表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系
　　Log-Rank單因素生存分析顯示，SOX8蛋白高表達(dá)組患者（36.5個(gè)月，n=28)術(shù)后生存時(shí)間顯示短于低表達(dá)組患者(48.7個(gè)月，n=49， P=0.006)。
　　結(jié)論：
　　1.S

7、OX8在正常支氣管肺組織中未觀察到明顯表達(dá)。
　　2.SOX8在NSCLC中高度表達(dá)，同時(shí)與腫瘤體積、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分級(jí)存在顯著的相關(guān)關(guān)系。SOX8可能與NSCLC細(xì)胞的增殖性和侵襲性存在某種相關(guān)關(guān)系。
　　3.在NSCLC患者中，SOX8高表達(dá)組的預(yù)后顯著差于低表達(dá)組，提示SOX8表達(dá)程度可以作為臨床判斷NSCLC的有效指標(biāo)。
　　第二部分 miRNA-124治療非小細(xì)胞型肺癌的體外研究
　　目的：

8、
　　在本部分將通過TargetScan等軟件預(yù)測(cè)可能的miRNA，并驗(yàn)證該miRNA即miRNA-124與SOX8基因間的相互作用關(guān)系以及miRNA-124過表達(dá)及抑制劑對(duì)NSCLC細(xì)胞系增殖和遷移的影響。
　　方法：
　　1.利用公眾專業(yè)檢索軟件對(duì)SOX8基因的調(diào)節(jié)性miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)
　　利用TargetScan，MicroCosm Targets version5和microRNA.org數(shù)據(jù)庫對(duì)SOX8

9、可能的上游效應(yīng)miRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)及SOX83'UTR可能與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)
　　2.檢測(cè)NSCLC組織和正常肺組織中miRNA-124的表達(dá)情況
　　利用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-124在NSCLC組織中miRNA-124的表達(dá)情況并進(jìn)行比較。
　　3.對(duì)miRNA-124與SOX8相互作用進(jìn)行驗(yàn)證
　　驗(yàn)證方法為擴(kuò)增包含SOX83'UTR結(jié)合位點(diǎn)的片段，并利用試劑盒制作結(jié)合位點(diǎn)的突變型片段。然后利用熒

10、光素酶基因報(bào)告手段進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.利用miRNA-124 mimic和miRNA-124 inhibitor驗(yàn)證miRNA-124對(duì)NSCLC增殖能力和遷移能力的影響
　　首先利用lipofectin試劑盒將miRNA-124 mimic和miRNA-124 inhibitor轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，然后CCK-8檢測(cè)兩種試劑對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，并利用Transwell檢測(cè)方法檢測(cè)2種

11、細(xì)胞系接受處理后遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.NSCLC患者腫瘤組織中miRNA-124表達(dá)量降低
　　在本部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在9個(gè)配對(duì)的NSCLC樣本中，有8組腫瘤組織的miRNA-124的表達(dá)量顯著低于臨近的正常肺支氣管組織(8/9，88.9％)
　　2.SOX8是miRNA-124的靶點(diǎn)基因
　　在熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)與突變型SOX83'UTR片段相比較，miRNA-124使野

12、生型SOX83'UTR片段的相對(duì)熒光活性降低(P=0.002)。在NSCLC細(xì)胞系H1299中，通過Western blot檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-124 mimics降低了SOX8蛋白質(zhì)的表達(dá)，而miRNA-124抑制物則使SOX8蛋白的表達(dá)升高，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-124對(duì)SOX8基因的調(diào)控作用。
　　3.miRNA-124高表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力
　　在本部分試驗(yàn)中我們分別用miRNA-1

13、24 mimic（模擬miRNA124高表達(dá)）和miRNA-124 inhibitor分別轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，miRNA-124 mimic降低了兩種細(xì)胞系的增殖能力，而miRNA-124 inhibitor則起到了相反的作用，增強(qiáng)了兩種細(xì)胞系的增殖能力（P＜0.05）。
　　4.miRNA-124高表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞系的細(xì)胞遷移能力
　　在上一步部分試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)SOX8的過度

14、表達(dá)與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)關(guān)系，因此在本部分試驗(yàn)中我們分別用miRNA-124 mimic（模擬miRNA-124高表達(dá)）和miRNA-124 inhibitor分別轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，并利用Transwell實(shí)驗(yàn)研究了miRNA-124對(duì)細(xì)胞系遷移能力影響。結(jié)果顯示，miRNA-124 mimic顯著抑制了A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的遷移能力(P＜0.05)，而miRNA-124 inhibi

15、tor則增強(qiáng)了兩種NSCLC細(xì)胞系的遷移能力，結(jié)果顯示miRNA-124的高表達(dá)可以有效降低NSCLC細(xì)胞系的遷移能力。
　　結(jié)論：
　　1.miRNA-124在NSCLC中的表達(dá)低于正常肺組織
　　2.miRNA-124是SOX8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，miRNA-124的過表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上降低SOX8基因的表達(dá)。
　　3.miRNA-124過表達(dá)可以有效降低人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299的增殖

16、能力和遷移能力。
　　第三部分 miRNA agomir-124治療非小細(xì)胞型肺癌裸小鼠皮下種植瘤模型的研究
　　目的：
　　在本部分中決定對(duì)裸鼠NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549皮下種植瘤模型利用miRNA agomir124進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法：
　　利用人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549建立裸小鼠皮下種植瘤，在建模8天后進(jìn)行miRNAagomir-124進(jìn)行處理（1 nmol/50μ L，每隔4天1次）。每隔4

17、天測(cè)量腫瘤體積變化，并在建模后第36天處死小鼠，取瘤并稱重。
　　結(jié)果：
　　1.miRNA agomir-124對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響
　　與對(duì)照組（空白對(duì)照組）相比，實(shí)驗(yàn)組(miRNA agomir-124治療組)自腫瘤后16天起的皮下種植瘤體積增加速度減慢(P＜0.01)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)所取瘤體治療顯著減小(411.8 mg vs.227.1 mg， P＜0.01)，抑瘤率為38.5％。

18、
　　結(jié)論：
　　1.人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549裸小鼠皮下種植瘤建模成功。
　　2.miRNA agomir-124可以作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究miRNA-124功能的理想工具。
　　3.模擬miRNA-124高表達(dá)的miRNA agomir-124可以有效抑制NSCLC皮下種植瘤的生長(zhǎng)，與細(xì)胞水平研究結(jié)果一致，證實(shí)miRNA-124是抑制NSCLC腫瘤生長(zhǎng)的抑癌因子。利用miRNA-124治療NSCLC腫瘤是一種可能