口服避孕藥保護卵巢儲備功能預(yù)防化療對大鼠卵巢損傷的動物研究.pdf

1、研究背景: 卵巢早衰(prematureovarianfailurePOF)系指婦女在40歲以前絕經(jīng)，常表現(xiàn)為雌激素水平降低引起的月經(jīng)紊亂、不孕、圍絕經(jīng)期綜合征等一系列癥狀。POF病因復(fù)雜，目前仍不清楚，化療遠期毒副作用是其中之一。隨著化學(xué)毒性藥物在腫瘤及自身免疫疾病的廣泛應(yīng)用，其導(dǎo)致的性腺功能損害成為研究新熱點，其中以環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)為代表的烷化劑引起的卵巢功能損害研究較多，但其作用機制仍不

2、清楚。一些研究顯示，CTX可直接損傷卵巢顆粒細胞，并主要作用于有絲分裂活躍的卵泡，而靜止的生殖細胞呈低度敏感。另有學(xué)者提出，化療期間應(yīng)用口服避孕藥抑制卵泡發(fā)育，能夠減少化療對卵巢的損害，依據(jù)是化療藥物損傷卵巢的機制和口服避孕藥的作用機理，即通過雌孕激素負反饋抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，從而抑制卵泡發(fā)育，儲存原始卵泡，保護卵巢儲備功能，減少卵巢損傷。相關(guān)研究也證實口服避孕藥能夠降低及預(yù)防化療對卵巢的損傷，促進化療后卵巢功能甚至是生殖功能的恢

3、復(fù)。但也有學(xué)者持不同觀點，結(jié)論尚有爭議。本研究旨在探討化療期間應(yīng)用口服避孕藥能否保護卵巢功能，以確定口服避孕藥的有效性。 目的: 本文采用陰道涂片法監(jiān)測大鼠動情周期，放射免疫法和組織切片法，檢測大鼠血清雌二醇(E2)水平、卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及卵泡數(shù)量，并通過統(tǒng)計學(xué)分析，比較實驗前后各組實驗指標變化，探討口服避孕藥在化療期間有否起到保護卵巢的作用及其相關(guān)機制。 材料與方法: 1.SPF級近交

4、系雌性Wistar大白鼠，3月齡，體重180g～200g，購自中山大學(xué)實驗動物中心。喂食SPF級鼠飼料及凈化水，室溫20℃～25℃，相對濕度45％～55％，每日光照12h，飼養(yǎng)1周熟悉環(huán)境后，每日清晨9:00行陰道細胞涂片，顯微鏡下觀察動情周期，選用有正常動情周期的大鼠進入實驗?？诜茉兴?OC)--達英-35(35μg炔雌醇/2mg醋酸環(huán)丙孕酮)由先靈(廣州)藥業(yè)有限公司提供。環(huán)磷酰胺(CTX)，規(guī)格0.2g×10支，購自山西普德藥業(yè)

5、有限公司。 2.預(yù)實驗，以確定最大程度抑制大鼠卵泡發(fā)育的最低OC劑量：12只雌性Wistar大鼠隨機分為3組，灌胃給予不同劑量OC，第1組：4.375μg炔雌醇/0.25mg醋酸環(huán)丙孕酮；第2組：8.75μg炔雌醇/0.5mg醋酸環(huán)丙孕酮；第3組：17.50μg炔雌醇/1mg醋酸環(huán)丙孕酮。灌胃后每天行陰道涂片，并在第10天的動情間期測定各組E2、FSH濃度并進行比較。 3.動物實驗：75只Wistar雌性大鼠隨機分為5組

6、：①空白對照組：不予任何藥物處理；②CTX組：負荷劑量50mg/kg腹腔注射，之后8mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)14d；③OC組：8.75gg炔雌醇/0.5mg醋酸環(huán)丙孕酮(溶于1ml生理鹽水)，灌胃，連續(xù)25d；④聯(lián)合治療Ⅰ組：同時給予CTX和OC，連續(xù)15d，給藥方法同②、③組；⑤聯(lián)合治療Ⅱ組：先連續(xù)10d給予OC灌胃，用藥劑量同③組；第11d起加用CTX，給藥方法、時間及劑量同④組。 4.采用陰道涂片法監(jiān)測大鼠動情周期

7、，放射免疫法測定E2、FSH濃度，試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。所有卵巢標本均經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。 從實驗開始到結(jié)束，各組大鼠每天行陰道涂片，并于給藥結(jié)束前，每隔5天(相當于大鼠1個正常動情周期)，于動情間期測定各組E2、FSH濃度：停藥后第15、30天(相當于3及6個正常動情周期)，測定各組E2、FSH濃度。另外，停藥當天、第15、30天，分別處死各組1/3大鼠，比較卵巢重量、卵泡數(shù)量變化。

8、 5.統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0軟件包檢驗分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用的具體統(tǒng)計學(xué)方法有單向方差分析、重復(fù)測量、析因分析，兩兩比較采用SNK及LSD法，所有結(jié)果均以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.預(yù)實驗各組大鼠E2、FSH濃度及動情周期變化第1組給藥后，動情周期持續(xù)存在，E2、FSH濃度高于第2、3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第2、3組給藥7～9天后均出現(xiàn)持續(xù)不排卵，且兩組間E

9、2及FSH分別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示將OC劑量從8.75μg/0.5mg增加到17.5μg/1mg，不能增加抑制大鼠卵泡發(fā)育及排卵的程度，故認為8.75μg炔雌醇/0.5mg醋酸環(huán)丙孕酮這組劑量是可以抑制大鼠卵泡發(fā)育的最低有效劑量。 2.各組大鼠E2、FSH濃度及動情周期變化 (1)大鼠E2、FSH行重復(fù)測量分析，結(jié)果示各組、各時間點E2、FSH分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且實驗

10、分組和時間均有交互作用(P<0.05)。 (2)空白對照組：于動情間期測定E2(52.22±2.92)pg/ml，F(xiàn)SH(3.71±0.21)mIU/ml。陰道涂片呈正常大鼠動情周期改變。 (3)CTX組：從給藥第5天至實驗結(jié)束，E2持續(xù)下降，F(xiàn)SH持續(xù)上升，與同期其余4組E2、FSH分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陰道涂片見該組大鼠在給藥3～5天后出現(xiàn)持續(xù)不排卵，至實驗結(jié)束，動情周期仍未恢復(fù)。 (

11、4)OC組：從給藥第5天至停藥第15天，該組E2、FSH濃度均低于同期空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。停藥第30天，E2、FSH濃度分別與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陰道涂片見該組大鼠在給藥7～9天后出現(xiàn)持續(xù)不排卵，停藥20天左右恢復(fù)正常動情周期。 (5)聯(lián)合治療Ⅰ組：在聯(lián)合給藥第5天，E2高于CTX組，低于其余3組，而FSH低于CTX組及空白對照組，高于其余2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

12、.05)。聯(lián)合給藥第10天、停藥當天、15天，E2均高于同期CTX組，低于空白對照組，F(xiàn)SH低于CTX組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與同期其余2組E2、FSH相比，均無差異(P>0.05)。停藥第30天，E2高于CTX組，F(xiàn)SH低于CTX組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與其余3組分別比較，均無差異(P>0.05)。陰道涂片見該組大鼠于給藥4～5天后出現(xiàn)持續(xù)不排卵，停藥20天左右恢復(fù)正常大鼠動情周期。

13、 (6)聯(lián)合治療Ⅱ組：先給予OC藥物的前10天，E2、FSH與同期OC組相比，均無差異(P>0.05)。之后，在聯(lián)合給藥第5天，E2高于CTX組及聯(lián)合治療Ⅰ組，低于空白對照組，同期FSH低于CTX組、空白對照組及聯(lián)合治療Ⅰ組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而E2、FSH分別與OC組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合用藥第10天、停藥當天、15天，E2均高于CTX組，低于空白對照組，同期FSH均低于空白對照組及CTX組，

14、差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而E2、FSH分別與其他2組比較，均無差異(P>0.05)。停藥第30天，E2明顯高于CTX組，F(xiàn)SH明顯低于CTX組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與其余3組分別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陰道涂片見該組大鼠在給藥7～9天后出現(xiàn)持續(xù)不排卵，停藥20天左右恢復(fù)正常動情周期。 (7)比較聯(lián)合治療I、Ⅱ組的E2濃度，在聯(lián)合給藥第5天，前者低于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。之后2組每次

15、測定的E2比較，聯(lián)合治療Ⅱ組均高于Ⅰ組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 3.各組大鼠卵巢重量的變化 (1)大鼠卵巢重量行析因分析，結(jié)果示各組、各時間點卵巢重量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=137.561，P=0.000；F=39.511，P=0.000)，且實驗分組和時間有交互作用(F=14.188，P=0.000)。 (2)空白對照組大鼠卵巢重量為(68.73±3.97)mg。 (3)OC組和聯(lián)合治

16、療I、Ⅱ組，在停藥當天，大鼠卵巢重量降低，分別與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而3組之間相互比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。之后3組卵巢重量均持續(xù)增長，至停藥第30天，3組基本恢復(fù)正常大鼠卵巢重量水平，與同期空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同期分別比較聯(lián)合治療I、Ⅱ組的卵巢重量，Ⅱ組均高于Ⅰ組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(4)CTX組按時間依次測定的卵巢重量，一直呈持續(xù)性下降，

17、分別與同期其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 4.各組大鼠卵泡數(shù)量的變化 結(jié)論: 1.環(huán)磷酰胺損傷大鼠各期卵泡，尤其是成熟卵泡，并且對卵泡生長有刺激作用，加速原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡，最終導(dǎo)致各級卵泡耗竭。 2.口服避孕藥通過雌孕激素負反饋作用，抑制了大鼠卵泡發(fā)育和生長，儲存了大量原始卵泡，有效保護了卵巢儲備功能。 3.聯(lián)合治療組中口服避孕藥的應(yīng)用，減少了卵泡對環(huán)磷酰胺的敏感性，降低了