抗生長(zhǎng)分化因子-9抗體對(duì)化療所致大鼠卵巢損傷的保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢功能早衰(premature ovarian failure,POF)是指月經(jīng)初潮年齡正?；蚯啻浩谘舆t、第二性征發(fā)育正常的女性在40歲之前出現(xiàn)持續(xù)性不可逆性閉經(jīng)(>12個(gè)月),伴高促性腺激素狀態(tài):血清卵泡刺激素(FSFH>40IU/L 及雌二醇(E2)<25pg/ml,并出現(xiàn)雌激素缺乏的癥狀:如性欲減退、潮熱、出汗、骨質(zhì)疏松、閉經(jīng)等,甚至導(dǎo)致不孕。據(jù)統(tǒng)計(jì),40歲以前POF發(fā)生率為1％,30歲以前發(fā)生率為1‰

2、。原發(fā)性閉經(jīng)中POF占20％～25％,繼發(fā)性閉經(jīng)中占10％～20％。卵巢早衰具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,其可能的因?yàn)榘?①相關(guān)基因異常:如x染色體的缺失、易位和點(diǎn)突變等；②免疫因素:據(jù)統(tǒng)計(jì),大約10％～15％的POF與免疫因素有關(guān)。自身免疫性POF患者常合并其他自身免疫性疾病,如阿狄森(Addison)氏病,系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等；③感染:如盆腔炎、流行性腮腺炎病史,風(fēng)疹、麻疹病毒感染史等；④酶缺陷:研究證實(shí)7-a羥化酶及17,20碳

3、鏈裂解酶等甾體激素合成關(guān)鍵酶的缺乏與POF相關(guān)；⑤醫(yī)源性因素:如放療、化療等；⑥農(nóng)藥等毒物接觸史,吸煙、吸毒等；⑦心理因素；⑧其他。
　　 預(yù)防或減輕化療導(dǎo)致的卵巢損傷,緩解由于低雌激素導(dǎo)致的潮熱、出汗、煩躁、骨質(zhì)疏松等臨床癥狀,目前臨床上主要的方法有:①藥物:如促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-a)、口服避_孕藥等。②冷凍技術(shù):包括冷凍胚胎、冷凍卵母細(xì)胞和體外成熟、冷凍卵巢及移植等。而目前尚無特別有效、安全及可長(zhǎng)期使用的方法

4、。目前臨床上常用GnRH-a預(yù)防化療引起的卵巢損傷,但對(duì)已經(jīng)造成的損傷則沒有作用,且長(zhǎng)期使用有較重的并發(fā)癥,價(jià)格較貴也限制了它的臨床應(yīng)用。補(bǔ)充性激素是目前臨床最常用的方法,但雌激素在某些激素依賴性腫瘤中的應(yīng)用受到限制:如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等。
　　 生長(zhǎng)分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)是由卵母細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(糖蛋白)。大量研究證實(shí)其在卵泡的發(fā)育過程中起著不可缺少的作用

5、。卵泡發(fā)育分為不依賴促性腺激素階段和依賴促性腺激素階段:從始基卵泡到初級(jí)卵泡(竇前卵泡),此階段不受生殖激素的調(diào)節(jié),以后則在促性腺激素及甾體激素的作用下發(fā)育成為成熟卵泡,而GDF-9主要在前一階段起作用。GDF-9能通過旁分泌方式對(duì)卵泡的生長(zhǎng)和分化起著重要的作用,促進(jìn)卵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及有絲分裂。有研究發(fā)現(xiàn),將人卵巢上皮組織培養(yǎng)于存在或缺少重組小鼠GDF-9的培養(yǎng)基中,一周后發(fā)現(xiàn)加入了重組GDF-9的培養(yǎng)基中的卵泡有53％達(dá)到第二階段,

6、同時(shí)發(fā)現(xiàn)卵泡的活力也有所增強(qiáng),而對(duì)照組僅31％達(dá)到第二階段。另有研究證實(shí),GDF-9在體外可使人類卵巢組織中大量始基卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng),減少卵泡閉鎖,促進(jìn)卵泡存活。Shimizu T等研究發(fā)現(xiàn),直接給母豬卵巢注射豬的GDF-9基因片段,可促使卵泡發(fā)育,初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡的數(shù)量增加,原始卵泡數(shù)量減少。通過RNA干擾技術(shù),體外阻斷竇前卵泡向竇狀卵泡過渡期GDF-9的表達(dá),發(fā)現(xiàn)竇前卵泡的基礎(chǔ)發(fā)育及FSH誘導(dǎo)的發(fā)育均受阻。GDF-9基因敲除

7、的小鼠卵泡受阻在初級(jí)卵泡階段,不形成優(yōu)勢(shì)卵泡,無法排卵,導(dǎo)致不孕。Gilchrist等發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞分泌的GDF-9的活性可被特異性抗GDF-9抗體mAB-GDF-9-53中和,使卵泡停滯在初級(jí)卵泡階段,而不引起卵泡閉鎖。
　　 化療的細(xì)胞毒性常作用于分裂增殖期的細(xì)胞,處于靜止期的卵泡可防止受損害。化療藥物中以烷化劑最容易引起卵巢損傷,而烷化劑中以CTX最具有代表性,CTX在體外無活性,磷酰胺氮芥(Glyciphosphoram

8、ide,PM)為其最終代謝產(chǎn)物,具有體外活性。為此,本研究采用PM作為引起體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷的藥物,建立體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷的模型,在給予PM的同時(shí)加入抗GDF-9抗體中和GDF-9,觀察是否可使卵泡發(fā)育停滯在早期階段,阻止原始卵泡向成熟卵泡轉(zhuǎn)變,使卵巢中的卵泡盡可能多的處于對(duì)化療藥物低敏感的狀態(tài),從而減輕化療對(duì)卵泡的損傷。
　　 第一部分 確定引起體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷的磷酰胺氮芥的適宜劑量
　　 目的：
　　

9、 觀察不同劑量的磷酰胺氮芥(Glyciphosphoramide,PM)引起體外培養(yǎng)大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌功能損傷的情況,確定一個(gè)適宜濃度,作為建立體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷模型的劑量,并用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 方法:
　　 無菌條件下分離大鼠卵巢。實(shí)驗(yàn)分為4組,正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3組。每組12個(gè)卵巢,來源于出生8周的Wistar大鼠(體重180～200 g)。4組均先只加入1ml培養(yǎng)基(a-MEM+10％FBS+0

10、.075IU/ml hMG+1％ITS+1％雙抗),24h后更換全液,實(shí)驗(yàn)1、2、3組培養(yǎng)基中分別加入濃度為10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的磷酰胺氮芥(PM),正常對(duì)照組培養(yǎng)基中不含PM,培養(yǎng)48h后均隔天全量更換不含PM的培養(yǎng)基(即PM作用48h),共培養(yǎng)7d(即加入PM的6d)。在加入PM前及加入后2d(48h)、6d時(shí)更換的培養(yǎng)基用放射免疫法測(cè)定其雌二醇(E2)濃度。加入PM6d時(shí)取出大鼠卵巢,HE染色,顯微鏡下計(jì)

11、數(shù)各級(jí)卵泡總數(shù)。
　　 結(jié)論:
　　 3 種不同濃度的PM均可導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)的E2 濃度下降和各級(jí)卵泡總數(shù)減少,與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且PM劑量越大,大鼠的卵巢結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能損傷越重,即 E2 濃度下降及各級(jí)卵泡總數(shù)減少越明顯,故我們選擇了3 個(gè)劑量中最低的PM 濃度-10μg/ml 作為建立體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷模型的適宜劑量,并用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第二部分 抗生長(zhǎng)分化因子-9 抗體對(duì) PM

12、 所致大鼠卵巢損傷的治療作用的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 探討抗生長(zhǎng)分化因子-9抗體(Anti-GDF-9)對(duì)化療所致的體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷是否具有治療作用。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分為4組,共28個(gè)卵巢(14只 Wistar 大鼠),其中:①正常對(duì)照組6個(gè)；②PM組6個(gè)；⑨生理鹽水組6個(gè):加入1ml含0.075IU/ml hMG的生理鹽水；④PM+抗體組10個(gè):先加入10μg/ml的PM,24h

13、后加入Anti-GDF-9(5μg/ml)。正常對(duì)照組和生理鹽水組培養(yǎng)基中不含PM。PM均為單次給藥,作用48h后4組均隔天全量更換不含PM的培養(yǎng)基(或生理鹽水)。正常對(duì)照組、PM組、生理鹽水組的卵巢共培養(yǎng)8d,而PM+抗體組有6個(gè)卵巢培養(yǎng)8d,4個(gè)卵巢培養(yǎng)14d。培養(yǎng)8d及14d時(shí)按上述要求分別取出標(biāo)本,HE染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡總數(shù)。
　　 結(jié)論:
　　 體外培養(yǎng)大鼠卵巢 8d,PM+抗體組的卵泡總數(shù)雖較PM組多

14、,但仍少于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且PM+抗體組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(從8天到14天),各級(jí)卵泡總數(shù)的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明卵巢功能沒有恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)提示我們加入PM24h后再加入Anti-GDF-9并不能減輕PM所致的體外培養(yǎng)大鼠卵巢功能的損傷,根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,尚不能得出有治療作用的結(jié)論,但因樣本量較小,增加樣本量是否得出同樣的結(jié)論,尚需進(jìn)一步的研究。
　　 第三部分 抗生長(zhǎng)分化因子-9 抗體對(duì)化療所致體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷的保

15、護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 從大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌功能的改變,進(jìn)一步探討 Anti-GDF-9 對(duì)化療所致的體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷是否具有保護(hù)作用,為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。因上述實(shí)驗(yàn)PM+抗體組是在加入PM24h后方加入抗體,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,PM+抗體組對(duì)化療所致的體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷的治療作用不明顯。下步的實(shí)驗(yàn)結(jié)合抗體的中和作用原理,先加入抗體(Anti-GDF-9),用于中和卵母細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)分化因子

16、-9(growth differentiation factor 9,GDF-9),24h后再加入PM,觀察能否使卵泡停滯在早期發(fā)育階段,從而減輕化療對(duì)體外培養(yǎng)大鼠卵巢的損傷,起到保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 無菌條件下收集 Wistar 大鼠的卵巢,共96個(gè)(48只大鼠),隨機(jī)分為3組,每組 32 個(gè)卵巢:①正常對(duì)照組；②PM 組:加入10μg/ml的PM；③實(shí)驗(yàn)組:在給予 PM 前24h加入Anti-GDF-9。正

17、常對(duì)照組與 PM組先只加入lml培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組另在培養(yǎng)基中加入 Anti-GDF-9(5μg/ml)。培養(yǎng)24h后均全量更換培養(yǎng)基,其中正常對(duì)照組仍只加入 1ml 培養(yǎng)基,PM組和實(shí)驗(yàn)組均另在培養(yǎng)基中加入10μg/ml的PM,48h 后 3 組均隔天全量更換不含 PM的培養(yǎng)基(即 PM 只作用48h),共培養(yǎng)7d(即加入 PM的6d)。在加入 PM 前及加入PM2d、4d、6d時(shí)每組各時(shí)間點(diǎn)均分別取出8個(gè)大鼠卵巢,用 HE染色、切片,顯

18、微鏡下計(jì)算各級(jí)卵泡總數(shù)；另外,在上述的各時(shí)間點(diǎn)將更換下來的培養(yǎng)基用放射免疫法測(cè)量其 E2濃度。
　　 結(jié)論:
　　 體外實(shí)驗(yàn),在加入PM前24h加入Anti-GDF-9,能減輕PM所致體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷所引起的E2濃度降低和各級(jí)卵泡總數(shù)的減少,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,與PM組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,Anti-GDF-9對(duì)PM所致體外培養(yǎng)大鼠卵巢損傷具有一定的保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)采用的化療藥