馬兜鈴酸Ⅰ致人上尿路上皮細胞MMP9、VEGF、E-cadherin、ERK的活性變化.pdf

1、目的:
　　1.馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic acidⅠ，AAⅠ)是主要的腎毒素和致癌物，和馬兜鈴酸腎病或巴爾干地區(qū)性腎病及伴隨的上尿路腫瘤密切相關。中國，特別是沿海地區(qū)，是上尿路上皮腫瘤的高發(fā)地區(qū)，并且服用含馬兜鈴酸成分的中草藥可促進該尿路上皮的癌變。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在細胞的粘附過程中起關鍵作用，其缺失性表達將導致上皮細胞的惡性轉化。血管內皮生長因子(VEGF)被認為是各種癌變細胞血管生長的關鍵調節(jié)器

2、。此外，基質金屬蛋白酶(MMPs)在保護細胞微環(huán)境起著關鍵作用，MMP9被認為是腫瘤侵襲、惡性轉化、血管生成的關鍵因素。然而AAⅠ誘導癌變機制目前還未闡明，因此本次實驗的目的是探究AAⅠ誘導的可能癌變機制。分析AAⅠ能否誘導人永生化尿路上皮細胞(SV-HUC-1)MMP9、VEGF、E-cadherin的表達。
　　2.比較馬兜鈴酸相關上尿路腫瘤(upper urothelial carcinomas associated wit

3、hAAN，AA-UUC)和非AA相關(non-AA-UUC)的腫瘤病人MMP9、VEGF、E-cadherin的表達變化。
　　方法:
　　1.SV-HUC-1細胞暴露于AAⅠ(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)24 h、48 h、72 h，用MTT法測出細胞的增殖活力，相差顯微鏡觀察各濃度細胞的生長情況。
　　2.SV-HUC-1細胞暴露于低濃度的AAⅠ(2.5、5、10μg/ml)48h，用細胞組化、W

4、B蛋白印跡和實時熒光定量PCR分析MMP9、VEGF、E-cadherin的表達。用10μM的ERK1/2抑制劑(U0126)預先作用細胞作用1h，觀察MMP9、VEGF、E-cadherin的表達變化。
　　3.WB蛋白印跡比較AA-UUC和non-AA-UUC的MMP9、VEGF、E-cadherin、PERK的表達。
　　結果:
　　1.MTT細胞活力檢測表明不同濃度的AAⅠ作用于SV-HUC-1細胞24 h，與

5、對照組(DMSO)相比，各濃度AAⅠ的A570值（波長為570 nm處測定吸光度值）差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，表明AAⅠ對SV-HUC-1細胞增值無明顯作用。當作用時間增加至48 h及72 h時，隨著濃度的增加，各濃度AAⅠ的A570值和對照組相比有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），表明隨著AAⅠ濃度增加，對細胞增殖抑制作用也增加。相差顯微鏡觀察到溶劑對照組的SV-HUC-1細胞能保持正常細胞形態(tài)和細胞間隙。當細胞暴露于2.5μg/m

6、l of AAⅠ48 h后，細胞仍能保持正常的大小和形態(tài)。當細胞暴露于5.0μg/ml的AAⅠ48h后，AAⅠ對細胞的毒性作用表現(xiàn)為細胞失去增值能力，部分細胞失去典型的形態(tài)。增加濃度到10.0μg/ml，SV-HUC-1細胞開始變圓，表現(xiàn)出核固縮。繼續(xù)增加AAⅠ濃度至20.0μg/ml，SV-HUC-1細胞的細胞質開始出現(xiàn)空泡化。當細胞暴露于40.0μg/ml的AAⅠ48 h后，部分細胞的胞漿發(fā)生空泡化，細胞核固縮。
　　2.隨著

7、AAⅠ濃度的增加，MMP9、VEGF的mRNA和蛋白的表達逐漸增加，而E-cadherin的相應表達卻下降。然而，當SV-HUC-1細胞預先用ERK1/2信號通路抑制劑（10μM的U0126）作用1h，MMP9、VEGF蛋白的表達被抑制，而E-cadherin蛋白的表達恢復。
　　3.和non-AA-UUC相比，AA-UUC的MMP9、VEGF、PERK1/2的蛋白表達增加，而E-cadherin蛋白表達下降。
　　結論:<