馬兜鈴酸Ⅰ致人上尿路上皮細(xì)胞MMP9、VEGF、E-cadherin、ERK的活性變化.pdf

1、目的:
　　1.馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic acidⅠ，AAⅠ)是主要的腎毒素和致癌物，和馬兜鈴酸腎病或巴爾干地區(qū)性腎病及伴隨的上尿路腫瘤密切相關(guān)。中國(guó)，特別是沿海地區(qū)，是上尿路上皮腫瘤的高發(fā)地區(qū)，并且服用含馬兜鈴酸成分的中草藥可促進(jìn)該尿路上皮的癌變。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在細(xì)胞的粘附過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其缺失性表達(dá)將導(dǎo)致上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被認(rèn)為是各種癌變細(xì)胞血管生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器

2、。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在保護(hù)細(xì)胞微環(huán)境起著關(guān)鍵作用，MMP9被認(rèn)為是腫瘤侵襲、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成的關(guān)鍵因素。然而AAⅠ誘導(dǎo)癌變機(jī)制目前還未闡明，因此本次實(shí)驗(yàn)的目的是探究AAⅠ誘導(dǎo)的可能癌變機(jī)制。分析AAⅠ能否誘導(dǎo)人永生化尿路上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)MMP9、VEGF、E-cadherin的表達(dá)。
　　2.比較馬兜鈴酸相關(guān)上尿路腫瘤(upper urothelial carcinomas associated wit

3、hAAN，AA-UUC)和非AA相關(guān)(non-AA-UUC)的腫瘤病人MMP9、VEGF、E-cadherin的表達(dá)變化。
　　方法:
　　1.SV-HUC-1細(xì)胞暴露于AAⅠ(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)24 h、48 h、72 h，用MTT法測(cè)出細(xì)胞的增殖活力，相差顯微鏡觀察各濃度細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　2.SV-HUC-1細(xì)胞暴露于低濃度的AAⅠ(2.5、5、10μg/ml)48h，用細(xì)胞組化、W

4、B蛋白印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MMP9、VEGF、E-cadherin的表達(dá)。用10μM的ERK1/2抑制劑(U0126)預(yù)先作用細(xì)胞作用1h，觀察MMP9、VEGF、E-cadherin的表達(dá)變化。
　　3.WB蛋白印跡比較AA-UUC和non-AA-UUC的MMP9、VEGF、E-cadherin、PERK的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.MTT細(xì)胞活力檢測(cè)表明不同濃度的AAⅠ作用于SV-HUC-1細(xì)胞24 h，與

5、對(duì)照組(DMSO)相比，各濃度AAⅠ的A570值（波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定吸光度值）差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，表明AAⅠ對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞增值無(wú)明顯作用。當(dāng)作用時(shí)間增加至48 h及72 h時(shí)，隨著濃度的增加，各濃度AAⅠ的A570值和對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），表明隨著AAⅠ濃度增加，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用也增加。相差顯微鏡觀察到溶劑對(duì)照組的SV-HUC-1細(xì)胞能保持正常細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間隙。當(dāng)細(xì)胞暴露于2.5μg/m

6、l of AAⅠ48 h后，細(xì)胞仍能保持正常的大小和形態(tài)。當(dāng)細(xì)胞暴露于5.0μg/ml的AAⅠ48h后，AAⅠ對(duì)細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞失去增值能力，部分細(xì)胞失去典型的形態(tài)。增加濃度到10.0μg/ml，SV-HUC-1細(xì)胞開始變圓，表現(xiàn)出核固縮。繼續(xù)增加AAⅠ濃度至20.0μg/ml，SV-HUC-1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)開始出現(xiàn)空泡化。當(dāng)細(xì)胞暴露于40.0μg/ml的AAⅠ48 h后，部分細(xì)胞的胞漿發(fā)生空泡化，細(xì)胞核固縮。
　　2.隨著

7、AAⅠ濃度的增加，MMP9、VEGF的mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增加，而E-cadherin的相應(yīng)表達(dá)卻下降。然而，當(dāng)SV-HUC-1細(xì)胞預(yù)先用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑（10μM的U0126）作用1h，MMP9、VEGF蛋白的表達(dá)被抑制，而E-cadherin蛋白的表達(dá)恢復(fù)。
　　3.和non-AA-UUC相比，AA-UUC的MMP9、VEGF、PERK1/2的蛋白表達(dá)增加，而E-cadherin蛋白表達(dá)下降。
　　結(jié)論:<