曲古抑素A(TSA)預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的腦保護作用及機制研究.pdf

1、腦缺血再灌注損傷是臨床常見的病理生理表現(xiàn)。腦缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)被認(rèn)為是最強的神經(jīng)內(nèi)源性保護現(xiàn)象，但因其是損傷性預(yù)適應(yīng)，所以探討采用藥物誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)替代腦缺血預(yù)處理成為必然。
　　 臨床缺血性腦血管病中所占比重最大的是發(fā)生在大腦中動脈主干分布區(qū)的梗死，且常有自發(fā)性再通，目前常用的線栓法阻斷大腦中動脈復(fù)制出的腦缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlus

2、ion，MCAO)較符合這種病理生理學(xué)過程。即使阻斷大腦中動脈時間相同，腦梗死范圍卻不穩(wěn)定是線栓法復(fù)制MCAO模型的缺點。研究采用改良線栓及其他措施來復(fù)制穩(wěn)定性好的MCAO模型，才能為隨后的研究奠定可靠的基礎(chǔ)。
　　 隨著中國步入老齡化社會，缺血性腦血管疾病已成為常見病、多發(fā)病。計劃生育的實施，人們對獨生子女的健康問題更加關(guān)注，而神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的腦功能損傷，是目前亟待解決的兒科難題。雖然對缺血性腦損傷的機制研究甚多，但表觀遺傳

3、學(xué)方面的研究不多。
　　 曲古抑素A(trichostatin A，TSA)作為廣譜組蛋白去乙?；敢种苿?yīng)用廣泛，而其預(yù)處理是否對腦缺血再灌注損傷具有保護作用及其作用機制的研究較少，尤其是關(guān)于 TSA預(yù)處理對不同年齡大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制研究尚未見報道。
　　 通過了解TSA預(yù)處理對不同年齡大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，深入研究組蛋白乙酰化/去乙?；谌毖俟嘧⑦^程中腦損傷過程中的作用機制，從多個方面入手對此

4、病理生理進程實施干預(yù)，無疑將為積極防治缺血再灌注性腦損傷開拓新的應(yīng)用前景。
　　 第一部分、采用改良線栓法復(fù)制穩(wěn)定的大鼠MCAO模型
　　 1.1研究背景與目的：采用從頸總動脈或頸外動脈置入線栓，阻斷大腦中動脈血供一定時間之后再恢復(fù)灌注的動物模型，被認(rèn)為與臨床缺血性腦血管病中所占比重最大，且常有自發(fā)性再通的大腦中動脈主干分布區(qū)腦梗死的病理生理學(xué)過程相近似，所以應(yīng)用較多。進行藥物預(yù)處理實驗時，要求所選動物模型要符合臨床實際

5、，所得出的實驗結(jié)果才有應(yīng)用價值。所以本實驗采用栓塞大腦中動脈復(fù)制出的局灶性腦缺血模型(MCAO)進行曲古抑素A預(yù)處理的腦保護研究。
　　 線栓法MCAO模型的缺點是即使阻斷大腦中動脈時間相同，腦梗死范圍卻不穩(wěn)定。一定要復(fù)制出穩(wěn)定性好的MCAO模型，才能為隨后的研究奠定可靠的基礎(chǔ)。本實驗擬采用改良線栓及其它措施，從而復(fù)制出穩(wěn)定性好的MCAO模型。
　　 1.2材料與方法研究對象：健康清潔SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再

6、灌注組，每組各6只。
　　 動物模型：改良線栓阻斷大鼠大腦中動脈供血90min，再灌注24h制備大鼠MCAO模型。假手術(shù)組僅將線栓放置在頸外動脈內(nèi)。
　　 觀測指標(biāo)：HE染色、Zea-Longa神經(jīng)功能損害評分、腦梗死體積比。
　　 檢測方法：蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察手術(shù)側(cè)腦組織病理形態(tài)改變；缺血再灌注6h、12h、24h時間點使用Zea-Longa評分法進行神經(jīng)功能損害評分；TTC染色法測定大鼠腦梗死體積

7、比。
　　 數(shù)據(jù)分析：采用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。神經(jīng)功能學(xué)評分用中位數(shù)(范圍)表示。采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 1.3結(jié)果：
　　 (1)兩組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織HE染色顯示不同，缺血再灌注組腦損傷改變明顯，假手術(shù)組未發(fā)生損傷性改變。
　　 (2)兩組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能損害評分于缺血再灌注6h、12h、24h時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

8、0.01)。
　　 (3)TTC染色顯示缺血再灌注組有明確的梗死灶，對照組則無，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 1.4結(jié)論：
　　 本實驗采用改良線栓阻斷MCA法及其它措施復(fù)制的MCAO模型，穩(wěn)定性良好，值得推廣應(yīng)用。
　　 第二部分、不同劑量TSA預(yù)處理對MCAO大鼠IL-1β、bcl-2的影響
　　 2.1研究背景與目的：腦缺血再灌注損傷是臨床常見的病理生理表現(xiàn)。腦缺血預(yù)處理被認(rèn)為是

9、最強的神經(jīng)內(nèi)源性保護現(xiàn)象，但由于腦缺血預(yù)處理是損傷性預(yù)適應(yīng)，探討采用藥物誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)替代腦缺血預(yù)處理成為必然。TSA作為廣譜組蛋白去乙?；敢种苿?yīng)用廣泛，而其預(yù)處理是否有減輕腦缺血再灌注損傷作用及其作用機制少見報道。本研究擬探討不同劑量TSA預(yù)處理是否通過對血液和腦脊液中IL-1β含量、抗凋亡蛋白bcl-2等方面來減輕腦缺血再灌注損傷。
　　 2.2材料與方法
　　 研究對象：健康清潔SD雄性大鼠被隨機分為缺血再灌注對照

10、組(對照組)、0.1mg/kg TSA預(yù)處理組(TSA1組)、0.03mg/kg TSA預(yù)處理組(TSA2組)、1％DMSO預(yù)處理組(DMSO組)，每組又被分為缺血再灌注6h組、12h組、24h組、48h共4個亞組，每亞組6只大鼠。
　　 動物模型：采用前述改良線栓法阻斷大腦中動脈供血90min，再灌注6h、12h、24h、48h復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。TSA1組、TSA2組、DMSO組于缺血前20min分別經(jīng)尾靜脈注入

11、含有相應(yīng)藥物的生理鹽水1ml，對照組則注入相同體積的生理鹽水。
　　 觀測指標(biāo)：Zea-Longa神經(jīng)功能損害評分、腦梗死體積比、腦脊液和血液IL-1β含量變化、抗凋亡蛋白bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù)。
　　 檢測方法：神經(jīng)功能損害評分依據(jù)Zea-Longa評分法進行；蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察缺血側(cè)腦組織病理改變；ELISA法分析法檢測腦脊液和血清中IL-1β的含量變化；免疫組化法測定栓塞側(cè)大腦缺血半暗帶區(qū) bcl-2蛋

12、白陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 數(shù)據(jù)分析：采用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。采用兩因素方差分析處理因素、時間因素及其交互作用對神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比、腦脊液、血液IL-1β和bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù)的影響。如方差分析前提條件未得到滿足，采用相應(yīng)的非參數(shù)檢驗或穩(wěn)健方法作為替代。選擇α=0.05作為統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0完成統(tǒng)計分析。
　　 2.3結(jié)果：
　　 (1)與缺血再灌注6h時間點的對照組相比，

13、TSA1組神經(jīng)功能損害評分降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，其余各時間點的各組神經(jīng)功能損害評分比較無顯著差異(P>0.05)。
　　 (2)TSA1組大鼠腦梗死體積比均小于其余3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TSA2組及DMSO組腦梗死體積比小于對照組(P<0.05)。
　　 (3)TSA1組血液IL-1β含量低于對照組和DMSO組(P<0.05)；TSA2組與DMSO組無差別(P>0.05)，但均低于對照組(

14、P<0.05)。
　　 (4)Pearson相關(guān)分析顯示，腦梗死體積比與血IL-1β、腦脊液IL-1β高度相關(guān)，對應(yīng)的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.841和0.618，P<0.05。
　　 (5)再灌注6h時間點，對照組bcl-2計數(shù)低于其余3組，DMSO組和小劑量TSA均低于 TSA1組(P<0.05)；再灌注12h時間點，對照組、DMSO組和TSA2組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)，但3組均低于TSA1組(P<

15、0.05)；再灌注24h時間點，對照組bcl-2計數(shù)低于其余3組，DMSO組和小劑量TSA均低于TSA1組(P<0.05)；再灌注48h時間點，4組之間bcl-2計數(shù)彼此之間均有統(tǒng)計學(xué)差別(P<0.05)。
　　 2.4結(jié)論：
　　 (1)TSA預(yù)處理可降低血液和腦脊液中IL-1β的含量，增加抗凋亡蛋白bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 (2)TSA預(yù)處理可劑量依賴性減少MCAO大鼠缺血再灌注損傷時腦梗死體積比，對MC

16、AO大鼠可能有腦保護作用。
　　 第三部分、TSA預(yù)處理對MCAO大鼠腦組織中HDAC、乙?；M蛋白H3、乙?；M蛋白H4表達水平的影響
　　 3.1研究背景與目的：腦藥物預(yù)處理是指使用藥物刺激機體產(chǎn)生類似機體自身內(nèi)源性保護物質(zhì)而呈現(xiàn)腦保護作用，它是在缺血性預(yù)處理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylases inhibitors，HDACIs)通過作用于缺血性卒中損傷機制中的多個環(huán)

17、節(jié)減輕腦組織損傷，增加缺血后神經(jīng)元可塑性和促進功能恢復(fù)。此前研究提示TSA預(yù)處理可以減少腦脊液中IL-1β的含量、促進抗凋亡蛋白bcl-2表達，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，但其作用機制尚未明了。本研究擬探討TSA預(yù)處理對MCAO大鼠腦組織中HDAC、乙?；M蛋白H3(acetylaced H3，Ac-H3)、乙?；M蛋白H4(acetylaced H4，Ac-H4)表達水平的影響。
　　 3.2材料與方法研究對象：同第二部分

18、。
　　 動物模型：同第一部分。
　　 觀測指標(biāo)：栓塞側(cè)腦組織HDAC活性測定、Ac-H3、Ac-H4表達水平檢測。
　　 檢測方法：采用比色法檢測栓塞側(cè)腦組織HDAC活性；免疫印跡法測定栓塞側(cè)腦組織乙?；M蛋白H3、H4表達水平。
　　 數(shù)據(jù)分析：采用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。采用兩因素方差分析處理因素、時間因素及其交互作用對HDAC活性、Ac-H3、Ac-H4表達水平的影響。如方差分析前

19、提條件未得到滿足，采用相應(yīng)的非參數(shù)檢驗或穩(wěn)健方法作為替代。選擇α=0.05作為統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0完成統(tǒng)計分析。
　　 3.3結(jié)果：
　　 (1)大鼠局灶性腦I/R損傷后HDAC活性隨缺血再灌注時間延長呈上升趨勢。各組HDAC活性隨缺血再灌注時間延長而持續(xù)上升。TSA1組大鼠HDAC活性雖有明顯上升，但低于對照組和DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；TSA2組HDAC活性水平與DMSO組沒有差別，

20、但低于對照組；DMSO組與對照組沒有差別(P>0.05)。
　　 (2)各組Ac-H3、Ac-H4表達水平在缺血再灌注6h時間點均呈上升趨勢，至缺血再灌注12h時間點達高峰，隨后下降。各組在不同處理組和時間點之間乙?；M蛋白H3表達水平存在差別，TSA1組大鼠Ac-H3表達水平均高于其余3組；TSA2組與DMSO組Ac-H3表達水平均高于對照組，但這兩組間沒有差別。
　　 (3)各組在不同分組和時間點之間Ac-H4表達水

21、平存在差別，TSA1組大鼠Ac-H4表達水平均高于其余3組；TSA2組Ac-H4表達水平高于對照組，但與DMSO組沒有差別；DMSO組與對照組之間沒有差別。
　　 (4)HDAC活性改變與Ac-H3、Ac-H4表達水平的Spearman秩相關(guān)系數(shù)分別為0.400和0.200，沒有統(tǒng)計學(xué)學(xué)意義。但Ac-H3、Ac-H4表達水平的Spearman秩相關(guān)系數(shù)為0.964，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (5)Ac-H3表達水平均與腦脊液

22、和血液IL-1β表達水平高度相關(guān)，Spearman秩相關(guān)系數(shù)分別為1.0和0.8；Ac-H4僅與腦脊液IL-1β表達水平相關(guān)，秩相關(guān)系數(shù)為0.8，但與血液IL-1β表達水平的秩相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (6)Ac-H3、Ac-H4表達水平均與bcl-2表達水平高度相關(guān)，Spearman秩相關(guān)系數(shù)分別為1.0和0.8。
　　 3.4結(jié)論：
　　 (1)大鼠局灶性腦I/R損傷后腦組織HDAC活性隨缺血再灌注時間延

23、長呈上升趨勢，TSA對HDAC有抑制作用；
　　 (2)TSA預(yù)處理可上調(diào)腦組織中.Ac-H3、Ac-H4水平，從而對IL-1β、bcl-2產(chǎn)生影響，這可能是TSA預(yù)處理的腦保護作用機制之一。
　　 第四部分、大劑量TSA預(yù)處理對不同年齡組MCAO大鼠IL-1β、bcl-2的影響
　　 4.1研究背景與目的：隨著中國步入老齡化社會，缺血性腦血管疾病已成為常見病、多發(fā)病。計劃生育的實施，人們對獨生子女的健康問題更加

24、關(guān)注，而神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的腦功能損傷，是目前亟待解決的兒科難題。雖然對缺血性腦血管疾病的病理生理特點及治療機制研究甚多，但針對不同年齡大鼠表觀遺傳學(xué)方面的研究不多。此前研究提示TSA預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。為深入研究不同年齡大鼠腦缺血再灌注損傷的損傷機制，本研究擬采用大劑量TSA預(yù)處理不同年齡組MCAO大鼠，觀察其對大鼠血液和腦脊液中IL-1β含量、抗凋亡蛋白bcl-2的影響。
　　 4.2材料與方法：
　　

25、 研究對象：SD雄性大鼠分為老年組、青年組、幼年組，均采用0.1mg/kg TSA預(yù)處理，每組6只。
　　 動物模型：采用改良線栓法阻斷實驗大鼠大腦中動脈血供90min，再灌注24h制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。老年組、青年組、幼年組于缺血前20min分別經(jīng)尾靜脈注入含相應(yīng)藥物的生理鹽水共1ml。
　　 觀測指標(biāo)：神經(jīng)功能損害評分、腦梗死體積比、腦脊液和血液IL-1β、bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù)。
　　 檢測方法

26、：Zea-Longa評分法和Chen18分評分法進行神經(jīng)功能缺陷評分；采用TTC染色法測大鼠腦梗死體積比；蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察缺血側(cè)腦組織病理形態(tài)改變；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析(ELISA)法檢測腦脊液和血清中IL-1β的含量變化；免疫組化法測定栓塞側(cè)大腦缺血半暗帶區(qū)bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 數(shù)據(jù)分析：采用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。采用兩因素方差分析處理因素、時間因素及其交互作用對神經(jīng)功能評分、

27、腦梗死體積、腦脊液、血液IL-1β和 bcl-2計數(shù)的影響。如方差分析前提條件未得到滿足，采用相應(yīng)的非參數(shù)檢驗或穩(wěn)健方法作為替代。選擇α=0.05作為統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0完成統(tǒng)計分析。
　　 4.3結(jié)果：
　　 (1)不同年齡組大鼠在缺血再灌注6h、12h、24h時間點的神經(jīng)功能評分的單因素方差分析結(jié)果顯示，三組間Zea-Longa神經(jīng)功能損害評分無明顯差別(P>0.05)。
　　 (2)三組間缺血

28、再灌注6h、12h時間點的改良神經(jīng)功能損害程度評分無顯著差別(P>0.05)，在24h時間點有差別(P<0.05)。3組間兩兩比較結(jié)果顯示，老年組與幼年組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，老年組與青年組、青年組與幼年組之間無差別(P>0.05)。
　　 (3)幼年組大鼠在缺血再灌注24h時間點的平衡總評分明顯小于其余兩組大鼠(P<0.05)；運動總評分與老年組大鼠相比有差別(P<0.05)；而幼年組大鼠和青年組大鼠的反射總評分小

29、于老年組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)不同年齡組大鼠的腦梗死體積比的單因素方差分析結(jié)果顯示，三組間腦梗死體積比無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。
　　 (5)單因素方差分析結(jié)果顯示，不同年齡組大鼠血液和腦脊液中的IL-1β表達水平無差別(P>0.05)。
　　 (6)單因素方差分析結(jié)果顯示，不同年齡組大鼠bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù)3組間存在差別(P<0.05)。3組間兩兩比較結(jié)果顯示，幼年組和青年

30、組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)，但二者bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù)均低于老年組大鼠(P<0.05)。
　　 4.4結(jié)論：
　　 TSA預(yù)處理對腦脊液中IL-1β含量以及抗凋亡蛋白bcl-2表達因年齡而作用不同。大劑量TSA預(yù)處理可能對不同年齡組MCAO大鼠具有腦保護作用。
　　 第五部分、TSA預(yù)處理對不同年齡組MCAO大鼠腦組織中HDAC、Ac-H3、Ac-H4表達水平的影響
　　 5.1研究背景與目的

31、：研究認(rèn)為缺血耐受指的是特定的時間被出現(xiàn)的特殊刺激激發(fā)產(chǎn)生的適應(yīng)性級聯(lián)反應(yīng)，包括基因依賴性反應(yīng)和非基因依賴性反應(yīng)，即已存在蛋白的翻譯后修飾。預(yù)處理是機體器官在基因水平上對缺血反應(yīng)“重新編程”的過程。組蛋白乙?；腿ヒ阴；悄壳把芯孔顬樯钊氲牡鞍追g后修飾機制。此前研究提示TSA預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。為深入研究不同年齡大鼠腦缺血再灌注損傷的損傷機制，本研究擬針對不同年齡組采用TSA預(yù)處理，觀察各組大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷

32、的腦組織中HDAC、Ac-H3、Ac-H4表達水平的改變，為探索新的治療方法打下基礎(chǔ)。
　　 5.2材料與方法研究對象：同第四部分。
　　 動物模型：同第四部分。
　　 觀測指標(biāo)：栓塞側(cè)腦組織HDAC活性、Ac-H3、Ac-H4表達水平。
　　 檢測方法：采用比色法檢測栓塞側(cè)腦組織HDAC活性；免疫印跡法測定栓塞側(cè)腦組織Ac-H3、Ac-H4表達水平。
　　 數(shù)據(jù)分析：采用Excel2007建立數(shù)

33、據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。采用兩因素方差分析處理因素、時間因素及其交互作用對HDAC活性、Ac-H3、Ac-H4表達水平的影響。如方差分析前提條件未得到滿足，采用相應(yīng)的非參數(shù)檢驗或穩(wěn)健方法作為替代。選擇α=0.05作為統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0完成統(tǒng)計分析。
　　 5.3結(jié)果：
　　 (1)老年組大鼠HDAC活性顯著高于幼年組和青年組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；幼年組和青年組HDAC活性水平?jīng)]有差別(P>0.05)

34、。
　　 (2)不同年齡組之間Ac-H3表達水平于缺血再灌注24h時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。幼年組和青年組Ac-H3表達水平顯著高于老年組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；幼年組和青年組Ac-H3表達水平?jīng)]有差別(P>0.05)。
　　 (3)不同年齡組大鼠的Ac-H4表達水平單因素方差分析結(jié)果顯示，三組間Ac-H4于缺血再灌注24h時間點高值，但三組間表達水平無差別。
　　 5.4結(jié)論：