內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留型抗TfR胞內(nèi)抗體的構(gòu)建及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響研究.pdf

1、鐵是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、代謝的必需元素，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的胞吞作用是細(xì)胞攝取鐵的主要途徑。腫瘤細(xì)胞由于增殖生長(zhǎng)旺盛，對(duì)鐵的需求高，所以腫瘤細(xì)胞有比正常細(xì)胞更多的與鐵代謝相關(guān)受體的表達(dá)和對(duì)鐵的攝取率，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵剝奪治療更敏感。研究證明鐵剝奪可在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。
　　 胞內(nèi)抗體技術(shù)是指應(yīng)用基因重組技術(shù)在非淋巴細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有生物活性的抗體，并通過對(duì)抗體分子進(jìn)行適當(dāng)修飾，使之定向分布于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或某些細(xì)

2、胞器中，從而特異性干擾或阻斷分布于該部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌過程，引起細(xì)胞的一系列生物過程發(fā)生改變。在腫瘤基因治療領(lǐng)域，胞內(nèi)抗體已應(yīng)用于阻斷、下調(diào)與其增殖密切相關(guān)的高表達(dá)受體或其他癌相關(guān)蛋白，如erbB-2、EGFR、VEGFR、葉酸受體等。胞內(nèi)抗體的發(fā)展開辟了一條通過抗原中和進(jìn)行表型或功能敲除的新途徑。
　　 目的：本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留型抗TfR的胞內(nèi)抗體，通過抗體與胞內(nèi)TfR相互作用抑制

3、腫瘤細(xì)胞膜TfR的高表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。探索通過抗TfR胞內(nèi)抗體達(dá)到腫瘤細(xì)胞鐵剝奪抗腫瘤的可行性。
　　 方法：利用兩步法加端PCR技術(shù)在抗TfR單鏈抗體 cDNA兩端引入信號(hào)肽序列、HA-tag序列及KDEL滯留信號(hào)，構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留型抗TfR單鏈抗體真核表達(dá)載體pIRES2-scFv-HAK-EGFP，同時(shí)設(shè)無滯留信號(hào)的表達(dá)載體pIRES2-scFv-HA-EGFP作為對(duì)照；采用

4、脂質(zhì)體將重組體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7；通過RT-PCR、western blot、激光共聚焦顯微術(shù)以及免疫電鏡檢測(cè)scFv基因表達(dá)及亞細(xì)胞定位；間接免疫熒光染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面TfR表達(dá)，real-time PCR檢測(cè)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA相對(duì)水平，了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞鐵代謝狀況；PI染色FCM分析細(xì)胞周期，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖與活力，熒光染色觀察細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：①表達(dá)載體通過酶切電泳鑒定可見目的基

5、因條帶，測(cè)序結(jié)果證明含有信號(hào)肽序列、HA-tag序列、KDEL滯留信號(hào)以及TfR-scFv目的基因，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)的抗TfR胞內(nèi)抗體真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；② RT-PCR和western blot檢測(cè)可見有scFv相應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)條帶；③激光共聚焦顯微術(shù)以及免疫電鏡觀察可見細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有scFv的定位表達(dá)；④間接免疫熒光FCM結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pIRES2-scFv-HAK-EGFP的腫瘤細(xì)胞表面TfR的表達(dá)顯著降低，提示胞內(nèi)表達(dá)的Tf

6、R-scFv能與胞內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，抑制其向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)；而real time PCR檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA水平顯著升高，提示有腫瘤細(xì)胞鐵吸收減少；⑤ PI染色FCM檢測(cè)細(xì)胞周期顯示轉(zhuǎn)染胞內(nèi)抗體基因scFv-HAK的腫瘤細(xì)胞有明顯G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖和活力檢測(cè)有明顯的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
　　 結(jié)論：首次提出并證明通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留型抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體胞內(nèi)抗體可以成功下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的高表達(dá)，減少腫