抗TfR基因工程抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其靶向腫瘤基因表達(dá)與效應(yīng)研究.pdf

1、第一部分 抗TfR人鼠嵌合抗體誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡及其機(jī)制 [目的]在前期構(gòu)建與表達(dá)抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)人鼠嵌合抗體，以及研究其腫瘤組織相對特異性分布，并能介導(dǎo)ADCC和CDC效應(yīng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討抗TfR人鼠嵌合抗體誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制。 [方法]①復(fù)蘇液氮中凍存的分泌抗TfR人鼠嵌合抗體的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，通過G418篩選后，用ELISA檢測轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清TfR人鼠嵌合抗體的表達(dá)；②將分泌嵌合

2、抗體的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞腹腔注射誘導(dǎo)裸鼠(Balb/c，nu/nu)腹水抗體，并經(jīng)DEAE-SephadexA-50離子交換柱層析法純化；③將抗體以不同濃度與K562細(xì)胞孵育，以活細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法檢測其對K562細(xì)胞生長與增殖的影響；④用瓊脂糖凝膠電泳，透射電鏡和AnnexinV-PI染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測K562細(xì)胞凋亡；⑤PI染色FCM檢測抗體對K562細(xì)胞周期的影響；⑥采用細(xì)胞色素C釋放試驗(yàn)和ELISA法檢測凋亡細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素

3、C和活化的caspase-8。 [結(jié)果]①1×105個轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞在20％FCS的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天的上清中分泌量為0.5μg/ml～5μg/ml。腹水所得純化的抗體濃度可達(dá)1～2mg/ml左右，表明液氮中凍存兩年的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌抗TfR的人-鼠嵌合抗體；②抗TfR抗體可明顯抑制K562細(xì)胞的增殖，在終濃度為25mg/ml到100mg/ml間具有劑量和時間的依賴性；③抗TfR抗體和K562細(xì)胞共孵育后，瓊脂糖凝膠電

4、泳可見典型的DNA梯形條帶；用透射電鏡可觀察到有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核不規(guī)則，核染色質(zhì)凝集并著邊，凋亡小體出現(xiàn)，其內(nèi)可見染色質(zhì)現(xiàn)象；FCM檢測K562細(xì)胞凋亡率為13.08％±2.01％，表明抗TfR抗體能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有時間-濃度依賴性；④PI染色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)抗TfR抗體將K562細(xì)胞的細(xì)胞周期阻止在G1期；⑤細(xì)胞凋亡時胞漿中細(xì)胞色素C有增加但活化的caspase-8沒有增加，表明該抗體通過線粒體死亡途徑誘

5、導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。 第二部分 抗TfRscFv-GAL4融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定 [目的]本研究構(gòu)建TfRscFv-GAL4的表達(dá)載體，并研究融合蛋白TfRscFv-GAL4與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性。 [方法]①采用PCR技術(shù)從含有抗TfRScFv質(zhì)粒pUC19中擴(kuò)增TfRScFv基因片段，雙酶切從含有GAL4質(zhì)粒pABgal4中獲得GAL4的基因片段，將TfRScFv和GAL4基因片段克隆至pET28

6、a(+)表達(dá)載體中，進(jìn)行測序；②將含抗TfRScFv-GAL4-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；SDS-PAGE電泳及光密度掃描鑒定其表達(dá)，體外復(fù)性、透析；③采用GAL4抗體ELISA檢測復(fù)性后的抗TfRScFv-GAL4融合蛋白中GAL4活性；④采用GAL4抗體FCM檢測復(fù)性后的抗TfRScFv-GAL4融合蛋白與不同腫瘤細(xì)胞株的結(jié)合，免疫組化染色檢測抗TfRScFv-GAL4融合蛋白與胃癌組織芯片和乳腺癌

7、組織芯片的結(jié)合特性。 [結(jié)果]①重組質(zhì)粒TfRScFv-GAL4-pET，用NcoI/NotI雙酶切，經(jīng)1％瓊脂糖電泳鑒定可見約1200bp的酶切產(chǎn)物，符合融合基因的理論值，登陸http：//www.ncbi.nlm.nh.gov/blast分析所得基因序列含有TfRScFv和GAL4序列，閱讀框正確；表明重組表達(dá)載體TfRScFv-GAL4-pET構(gòu)建成功；②TfRScFv-GAL4-pET重組表達(dá)載體陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

8、4h和6h時表達(dá)量最高，蛋白條帶灰度掃描顯示該特異性蛋白條帶約占菌體總蛋白的45％和42.3％，融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，分子量約為47KD左右，與理論計(jì)算值一致；通過純化、復(fù)性后，所得TfRScFv-GAL4融合蛋白的濃度為1.7mg/ml；③ELISA結(jié)果顯示，復(fù)性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白能被鼠源性GAL4抗體特異性識別；表明復(fù)性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中GAL4蛋白片段具有與抗體結(jié)合活性；④FCM檢測結(jié)果顯

9、示，復(fù)性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中TfRScFv能與腫瘤細(xì)胞表面TfR結(jié)合，在所檢測的7種腫瘤細(xì)胞株中，抗TfRScFv-GAL4融合蛋白與腫瘤細(xì)胞結(jié)合率在54.11％到8.23％之間，TfRScFv-GAL4組和鼠源性抗TfR抗體與各種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合率無明顯差別；組織芯片免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果顯示，復(fù)性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白和鼠源性抗TfR抗體均能與胃癌組織芯片與乳腺癌組織芯片特異性結(jié)合，染色后胃癌組織芯片陽性

10、率分別為75.32％和78.46％，乳腺癌兩張組織芯片陽性率分別為63.25％和64.57％；在正常組織中除5例肝組織中為弱陽性外，在心、脾、腎上腺皮質(zhì)、血管中均為陰性。以上結(jié)果表明，復(fù)性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中TfRScFv蛋白片段具有與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性。 第三部分 TfRscFv-GAL4融合蛋白靶向目的基因表達(dá)與效應(yīng) [目的]構(gòu)建報(bào)告基因與效應(yīng)基因的雙表達(dá)載體，研究TfRscFv-GAL4

11、融合蛋白靶向目的基因表達(dá)與效應(yīng)。 [方法]①體外合成GAL4DNABindingDomain的識別序列GAL4rec，將其插入SurvivinsiRNA-pGes載體中，酶切與測序鑒定；②4.5％非變性聚丙烯凝膠電泳分析GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes質(zhì)粒與抗TfRscFv-GAL4蛋白結(jié)合，以及兩者結(jié)合的摩爾比；③倒置熒光顯微鏡觀察TfRScFv-GAL4介導(dǎo)的靶向復(fù)合物內(nèi)吞作用及目的基因的表達(dá)；④Hoch

12、est染色檢測TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes復(fù)合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 [結(jié)果]①重組GAL4rec-SurvivinSiRNA-pGes載體經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定結(jié)果表明，插入識別序列GAL4rec后，載體質(zhì)粒不能被EcoRⅠ切成線性，在瓊脂糖凝膠電泳移動較快；②載體質(zhì)粒測序結(jié)果登陸http：//www.ncbi.nlm.nh.gov/blast分析表明，載體質(zhì)粒的測序報(bào)告中均可見插

13、入的GAL4rec片段，表明重組表達(dá)載體GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes構(gòu)建成功；③4.5％非變性的聚丙烯凝膠電泳可見抗TfRScFv蛋白加入不同濃度GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes載體，蛋白染色只有一條條帶；而GAL4蛋白和抗TfRScFv-GAL4蛋白隨加入的GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes載體量的增加，向上移位的蛋白增多，表明TfRscFv-GAL4融合蛋白可通過其中GA

14、L4片斷與GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes載體特異性結(jié)合；GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes和TfRScFv-GAL4蛋白結(jié)合的摩爾比為1∶2.5；④靶向復(fù)合物系統(tǒng)TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes和TfRScFv-GAL4-GAL4rec-pGes分別與4種人類腫瘤細(xì)胞共孵育后，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)，而其他各實(shí)驗(yàn)對照組均未見細(xì)胞內(nèi)有

15、綠色熒光蛋白表達(dá)。在光鏡下可見靶向復(fù)合物系統(tǒng)組有部分貼壁細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體趨于變園，似凋亡細(xì)胞的形態(tài)，而其他各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁，生長良好；⑤靶向復(fù)合物系統(tǒng)TfRscFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRN-pGes與2種人類腫瘤細(xì)胞共孵育后，用Hochest染細(xì)胞核觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，靶向復(fù)合物系統(tǒng)組可見大量的凋亡細(xì)胞，而其他組凋亡細(xì)胞較少；疊加照片顯示光鏡中所見胞質(zhì)回縮，胞體趨于變園的細(xì)胞，均為凋亡的細(xì)胞。 [結(jié)論

16、]①研究結(jié)果表明，抗TfR人鼠嵌合抗體可以明顯抑制K562人紅白血病細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡，通過線粒體死亡途徑是誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，可能與其干擾細(xì)胞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；②成功構(gòu)建并表達(dá)TfRscFv-GAL4融合蛋白，通過復(fù)性后其具有較好的生物活性，抗TfRScFv和GAL4融合沒有影響各自的功能；③首次證明抗TfRscFv-GAL4融合蛋白能與多種人類腫瘤細(xì)胞株以及多種腫瘤組織細(xì)胞結(jié)合，而與正常組織結(jié)合較弱或呈陰性反應(yīng)，表明融合