內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達(dá)的調(diào)控及其分子機(jī)制研究.pdf

1、TRAIL(TNF-related apoptosis inducing-ligand)是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死家族中第三個凋亡分子，其與細(xì)胞膜上的TRAIL受體DR4/5結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)作用。在免疫系統(tǒng)中，免疫細(xì)胞的凋亡是重要的免疫調(diào)節(jié)，是機(jī)體維持自身的穩(wěn)定，避免自身免疫疾病的重要機(jī)制。很多研究報道，TRAIL在自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)中表達(dá)，參與其對機(jī)體的免疫監(jiān)視

2、，可能在促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫耐受等方面有重要作用。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和運輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)器。對種種刺激相當(dāng)敏銳，蛋白質(zhì)折疊的需求增強或外界刺激等因素，均可引起ER蛋白折疊負(fù)荷和蛋白質(zhì)折疊能力之間的不平衡，導(dǎo)致錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白在ER腔內(nèi)蓄積，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。前期研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化的恢復(fù)過程

3、中，肝臟巨噬細(xì)胞可通過表達(dá)TRAIL促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)肝纖維化的恢復(fù)；ERS相關(guān)蛋白在肝纖維化病程中動態(tài)變化，ERS參與活化HSC凋亡的調(diào)控，其機(jī)制可能與其釋放細(xì)胞內(nèi)鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，從而誘導(dǎo)Calpain/Caspase和JNK/p38 MAPK激活有關(guān)。TRAIL可能通過誘導(dǎo)活化HSC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP，GRP78，Caspase-12的表達(dá)，從而促進(jìn)HSC的凋亡。ERS在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中可能起重

4、要作用，然而ERS是否參與巨噬細(xì)胞TRAIL表達(dá)的調(diào)控，從而促進(jìn)HSC凋亡，逆轉(zhuǎn)肝纖維化尚未有研究。本課題以三種不同來源的巨噬細(xì)胞為研究對象，旨在探討ERS對巨噬細(xì)胞TRAIL表達(dá)的調(diào)控及機(jī)制，從而進(jìn)一步完善肝纖維化發(fā)病及逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究。主要研究內(nèi)容如下：
　　1. ERS促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)TRAIL
　　為了研究ERS對巨噬細(xì)胞中TRAIL表達(dá)的影響，分別給予給予不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（Thapsigargin，T

5、G）和衣霉素（tunicamycin，TM），體外誘導(dǎo)小鼠 RAW264.7巨噬細(xì)胞株，THP-1細(xì)胞及原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測TRAIL的mRNA表達(dá)變化；免疫印跡觀察細(xì)胞內(nèi)TRAIL總蛋白的表達(dá)變化； ELISA方法檢測可溶性TRAIL蛋白（sTRAIL）的表達(dá)變化；流式細(xì)胞儀檢測ERS對膜結(jié)合型TRAIL蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩種誘導(dǎo)劑均上調(diào)TRAIL mRNA水平表達(dá)和可溶性及總蛋白的表達(dá)，而

6、對膜型TRAIL蛋白沒有顯著影響，提示ERS可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞TRAIL的表達(dá)。
　　2. MAPK通路參與ERS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TRAIL的表達(dá)
　　以RAW264.7細(xì)胞為研究對象，分別用1μM TG和1μg/ml TM刺激細(xì)胞0-24 h，采用Western blot法檢測MAPK各下游通路是否激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ERS能顯著誘導(dǎo)ERK，JNK和p38 MAPK蛋白的表達(dá)及激活，引起了細(xì)胞活化。再分別給予ER

7、K抑制劑PD98059，JNK抑制劑SP600125及p38 MAPK抑制劑SB202190處理，采用RT-PCR方法檢測TRAIL mRNA水平；Western blot方法檢測TRAIL和ERK、JNK、p38 MAPK蛋白及磷酸化的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TG和TM模型組相比，JNK抑制劑SP600125同時顯著下調(diào)了TRAIL mRNA及蛋白水平。提示JNK MAPK通路可能參與ERS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TRAIL的表達(dá)。
　　為了進(jìn)

8、一步探討JNK MAPK通路參與TRAIL表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，分別用1μM TG和1μg/ml TM刺激細(xì)胞24h后，使用ELISA法，RT-qPCR法，Western blot法及雙熒光素酶報告基因法檢測JNK MAPK的下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1（activator protein-1）的激活。結(jié)果顯示，ERS可使AP-1磷酸化及激活。進(jìn)一步給予AP-1抑制劑SR1130及轉(zhuǎn)染野生型TRAIL啟動子熒光素酶，采用RT-PCR法，RT-qPCR

9、法，Western Blot，ELISA，熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e檢測TRAIL mRNA，蛋白水平及熒光強度。結(jié)果顯示與TG，TM模型組相比，抑制AP-1通路明顯抑制TRAIL的表達(dá)。提示ERS誘導(dǎo)的活化巨噬細(xì)胞表達(dá)TRAIL的表達(dá)可能與JNK MAPK及AP-1信號通路有關(guān)。
　　3. SOCS3負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞ERS誘導(dǎo)的TRAIL的表達(dá)
　　為了觀察SOCS3對ERS誘導(dǎo)TRAIL的表達(dá)的影響，分別根據(jù)SOCS3的核

10、苷酸序列序列設(shè)計并合成小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及構(gòu)建好的pCMV-SOCS3質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR檢測SOCS3，TRAIL mRNA的水平；Western Blot法檢測SOCS3，TRAIL蛋白的水平；ELISA方法檢測可溶性TRAIL蛋白的表達(dá)變化。實驗結(jié)果表明，過表達(dá)SOCS3

11、可以明顯降低ERS誘導(dǎo)的TRAIL的表達(dá)上調(diào)作用，而沉默的SOCS3可增強ERS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TRAIL的表達(dá)。
　　4. SOCS3通過JNK/AP-1通路負(fù)性調(diào)節(jié)ERS誘導(dǎo)的TRAIL的表達(dá)
　　RT-qPCR及Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與TG和TM模型組相比，過表達(dá)SOCS3組可明顯降低模型組引起的AP-1各組分（c-Jun，c-Fos和JunB）mRNA及磷酸化蛋白表達(dá)的上調(diào)，而siRNA沉默SOC