hPER1相互作用蛋白的篩選及與近日節(jié)律關(guān)系的研究.pdf

1、本研究的主要目的是尋找人腦組織cDNA文庫中與hPER1蛋白相互作用的新蛋白，完善Perl相關(guān)的近日節(jié)律鐘控系統(tǒng)的詳細(xì)機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路。研究分為三個部分：1、人腦組織中與hPER1相互作用新蛋白的篩選與鑒定；2、新蛋白與hPER1相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的確定；3、新蛋白與hPER1的功能聯(lián)系的研究。 方法與結(jié)果： 第一部分：人腦cDNA文庫中與hPER1相互作用蛋白的篩選 方法：采用BD Clontech公司提供

2、的文庫構(gòu)建試劑盒（BD Matchmaker<'TM>Library Construction & Screening Kits）構(gòu)建人腦cDNA文庫。通過RT-PCR擴(kuò)增hPER1-PAS結(jié)構(gòu)域的編碼序列，獲得的片斷與質(zhì)粒載體pGBKT7連接重組為誘餌質(zhì)粒pGBKT7／hPer1<,PAS>。采用順序轉(zhuǎn)染法構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)（MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System，BD Clontech），篩選人腦cDNA

3、文庫中能與誘餌蛋白hPER1-PAS結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白。并且采用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、β-半乳糖苷酶印膜法檢測報告基因的表達(dá)；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確證蛋白間的相互作用。陽性克隆子經(jīng)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行測序和比對分析。 結(jié)果：成功構(gòu)建以pGBKT7／hPer1<,PAS>為誘餌蛋白的表達(dá)質(zhì)粒；構(gòu)建人腦cDNA文庫；成功構(gòu)建pGBKT7／hPer1<,PAS>和pGADT7-Rec／cDNA的酵母雙雜交系統(tǒng)，并經(jīng)過營養(yǎng)缺陷篩選、β-半乳糖苷酶印膜

4、法檢測以及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，總共篩選到28個陽性克隆子。其中一個經(jīng)過測序和序列比對，證實(shí)為RACK1<,131-306>片段。 第二部分 RACK1與PER1相互作用關(guān)鍵WD40結(jié)構(gòu)域的研究 方法：構(gòu)建5種含RACK1不同WD結(jié)構(gòu)域的重組質(zhì)粒：pGADT7-Rec/WD1-7；pGADT7-Rec/WD4-7；pGADT7-Rec/WD5-7；pGADT7-Rec/WD6-7；pGADT7-Rec/WDI-5，并鑒定。采

5、用共轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒pGBKT7/hPERl<,PAS>共轉(zhuǎn)染酵母AH109，轉(zhuǎn)化子依次在SD/-Leu/-Trp；SD/-His/-Leu/-Trp；SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp營養(yǎng)缺陷平板上鋪板生長。β-半乳糖苷酶印膜法檢測報告基因LacZ的表達(dá)。結(jié)果呈陽性的克隆子進(jìn)一步采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)與PER1的相互作用。 結(jié)果：成功構(gòu)建5種含RACK1不同WD結(jié)構(gòu)域的靶質(zhì)粒。雜交后結(jié)果顯示，

6、RACK1全長WD1-7（1-317aa）、C-端WD4-7（138-317aa）以及WD5-7（180-317aa）雜交后能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，并能激活報告基因LacZ的表達(dá)。而N-端WD1-5（1-224aa）和C-端WD6-7（219-317aa）與PER1PAS結(jié)構(gòu)域的雜交信號為陰性。表明RACK1的C端3個WD40結(jié)構(gòu)域?yàn)閮煞N蛋白結(jié)合所必需的位點(diǎn)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，全

7、長WD1-7、WD4-7和WD5-7蛋白片段能與誘餌蛋白hPER1-PAS結(jié)合，結(jié)合的關(guān)鍵部位位于第5至7WD40結(jié)構(gòu)域，即WD5-7才是RACK1與PER1相互作用的最小WD40結(jié)構(gòu)域片段。 第三部分 RACK1與PER1功能聯(lián)系的研究 方法：半定量RT-PCR檢測RACK1在人胎兒各組織中的表達(dá)。免疫組化法檢測RACK1在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。將pcDNA3.1-mPer1轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，通過RT-PC

8、R檢測RACK1表達(dá)量的改變；同時通過免疫組化法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RACK1分布的改變。四種hPER1干擾質(zhì)粒：pTER/hPER1-I（hper1：2155-2173）；pTER/hPER1-II（hper1：398-416）；pTER/hPER1-III（hper1：1653-1671）；pTER/hPER1-IV（hper1：3785-3803）分別轉(zhuǎn)染SH-YSY細(xì)胞后，檢測轉(zhuǎn)染效率。采用效率最高的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-Y5Y細(xì)胞，檢測

9、其對RACK1表達(dá)的影響。 結(jié)果：RACK1廣泛分布在人心、腦、肝、肺、腎、脾、小腸、骨骼、肌肉組織中，在各種組織中均有較高的表達(dá)，尤其以心臟中的表達(dá)量最高，而腦中的表達(dá)量相對其它組織較低。在細(xì)胞中，RACK1主要在細(xì)胞漿內(nèi)高表達(dá)，在細(xì)胞核中有一定量的表達(dá)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-mPer1的NIH3T3細(xì)胞中RACK1的表達(dá)未見明顯改變，說明RACK1的表達(dá)量不受PER1過表達(dá)的影響。但PER1的高表達(dá)伴隨RACK1的細(xì)胞分布改

10、變，即從散布胞漿到聚集于核周。四種hPer1干擾質(zhì)粒中，pTER/hPER1-II的干擾效率最高，達(dá)到了84.9％。將pTER/hPER1-II干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-Y5Y細(xì)胞后，能有效抑制hPer1的表達(dá)，但不能抑制Rack1的表達(dá)。 結(jié)論：RACK1是新的hPER1-PAS結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白，RACK1的WD5-7是與hPER1-PAS相互作用的最小結(jié)構(gòu)域。RACK1與PER1存在一定的功能聯(lián)系，PER1過表達(dá)能引起細(xì)胞內(nèi)RAC