乳腺癌細胞分泌的VEGF誘導血管內皮細胞免疫功能抑制的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著惡性腫瘤發(fā)病率的逐漸升高，腫瘤己成為威脅人類健康和生命最主要的疾病之一。據統(tǒng)計報告預測，2015年美國將有1，658，370例新發(fā)癌癥病例，并有589，430例死亡病例。近年來，中國的乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在女性腫瘤患者中，乳腺癌的發(fā)病率居所有腫瘤發(fā)病率的第1位，死亡率為第2位。乳腺癌的發(fā)生和轉移是一個多步驟、多因素的過程，它受到腫瘤本身和宿主免疫功能等因素的影響。近年來，隨著對乳腺癌研究的深入，人們越來

2、越認識到宿主的免疫功能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。乳腺癌細胞通過分泌VEGF、PGE2和TGF-β等因子和誘導正常宿主細胞完成免疫抑制功能，故許多腫瘤患者存在免疫功能低下。在被誘導的正常宿主細胞中，血管內皮細胞不僅是血管與周圍組織間的物理屏障，還可分泌免疫調節(jié)因子，發(fā)揮免疫調節(jié)功能，因此被認為與腫瘤細胞所誘導的免疫抑制有關，但其具體機制目前尚不清楚。本研究通過研究人和小鼠的乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞所分泌免疫因子的變化，旨在探

3、討乳腺癌細胞對血管內皮細胞的誘導作用和免疫抑制作用及其可能的機制。
　　研究方法:
　　乳腺癌細胞(MCF-7)培養(yǎng)24h，收集其培養(yǎng)上清離心后備用。血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)生長至70～80％融合后，分別給予1640培養(yǎng)基、VEGF及MCF-7的培養(yǎng)上清和SU5416+MCF-7的培養(yǎng)上清進行刺激24h，隨后換用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，收集其上

4、清液（條件培養(yǎng)基），一部分用ELISA法測定血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、IL-6和IL-12，另一部分刺激外周血T細胞后，進行CCK-8、ELISPOT及流式細胞學實驗。30只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分成3組，分別行第4對乳腺注射PBS、注射4T1細胞和注射4T1細胞+Celecoxib灌胃，作

5、為PBS組(n=10)、4T1組(n=10)及TC組(n=10)，建立小鼠乳腺癌模型。所有小鼠眼球摘除法取血，離心后收集血清，應用ELISA法分別測定PBS組、4T1組和TC組的白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-12(IL-12)。PBS組和4T1組的肺組織一部分以(q)RT-PCR和Western blot實驗測定環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達水平，另一部分分離小鼠肺血管內皮細胞(Mouse pulmona

6、ry vascular endothelial cell，MPVEC)并培養(yǎng)，用ELISA法測定培養(yǎng)上清中PGE2的表達水平。
　　研究結果:
　　1.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞免疫抑制因子分泌增加
　　ELISA實驗表明，經乳腺癌細胞(MCF-7)24h培養(yǎng)上清刺激后，血管內皮細胞(HUVEC)24h培養(yǎng)上清（T-sup組）中VEGF、PGE2和IL-6表達水平較Media組明顯升高。
　　2.乳腺癌細胞誘導血

7、管內皮細胞免疫增強因子分泌減少
　　ELISA實驗顯示，經MCF-7細胞24h培養(yǎng)上清刺激后，HUVEC細胞24h培養(yǎng)上清（T-sup組）中IL-12表達水平較Media組明顯降低。
　　3.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞促進T淋巴細胞凋亡
　　CCK-8實驗顯示，與對照組比較，以MCF-7細胞誘導后HUVEC細胞條件培養(yǎng)基處理T細胞，24h的0.D.值無明顯差異，48h的0.D.值降低，表明T細胞凋亡增加。
　　4

8、.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞抑制T淋巴細胞免疫功能
　　ELISPOT結果顯示，以MCF-7細胞誘導后HUVEC細胞條件培養(yǎng)基處理PBMC（主要為T淋巴細胞），T淋巴細胞IFN-γ的表達水平降低。
　　5.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞抑制CD8+T細胞活化
　　流式細胞學實驗顯示，以MCF-7細胞誘導后HUVEC細胞條件培養(yǎng)基處理T細胞24h，IFN-γ染色陽性的CD8+T細胞比例較對照組減少，而IFN-γ染色陽性的CD

9、4+T細胞比例較對照組無明顯差異。
　　6.荷瘤小鼠血液中免疫抑制因子含量增加
　　ELISA結果顯示，4T1組與PBS組相比，免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量升高。
　　7.荷瘤小鼠血液中免疫增強因子含量減少
　　ELISA結果顯示，4T1組與PBS組相比，免疫增強因子IL-12含量降低。
　　8.乳腺癌細胞分泌的VEGF在血管內皮細胞分泌免疫因子中的作用
　　ELISA實驗表明，MCF-72

10、4h培養(yǎng)上清中VEGF水平較HUVEC中明顯升高。VEGF組中VEGF、PGE2和IL-6水平較對照組升高，IL-12水平降低，加入VEGF受體拮抗劑SU5416后，各因子的表達水平與對照組無明顯差異。
　　9.荷瘤小鼠肺組織中COX-2和PGE2表達上調
　　(q)RT-PCR和Western blot顯示，COX-2在4T1組的表達均較PBS組上調。分離的4T1組MPVEC24h培養(yǎng)上清中，PGE2的水平也較PBS組的表

11、達水平高。
　　10.Celecoxib拮抗乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞的免疫抑制作用
　　ELISA結果顯示，TC組小鼠給予Celecoxib治療后，與4T1組相比，血清中免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量降低，IL-12含量升高，與PBS組相比無明顯統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　1.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞免疫功能抑制。
　　2.乳腺癌細胞誘導血管內皮細胞免疫功能抑制可能與VEGF誘導PGE2表達增