人Ⅰ型T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-1(Tim-1)的表達(dá)、純化及活性測(cè)定.pdf

1、Tim-1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-1)，又稱人甲型肝炎病毒受體-1(human hepatitis A virus receptor，hHAVcr-1)或腎損傷分子-1(kidney injury molecule1，KIM-1)，是Tim家族基因中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的分子。Tim-1表達(dá)于CD4+T細(xì)胞，在抗原刺激初期即開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，為T細(xì)胞的激活提供共刺激信

2、號(hào)，參與T細(xì)胞的增殖與分化，并可以抑制外周耐受的發(fā)生。Tim-1基因編碼蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，是一個(gè)由N末端免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域(IgV)、黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和一個(gè)帶有磷酸化基序的胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成。
　　Tim-1分子的編碼基因具有多態(tài)性和配體多樣性，這種特性與多種自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生有非常重要的關(guān)系。Tim-4是Tim-1的天然配體，Tim-1/Tim-4相互作用可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化增殖，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡。

3、因此，Tim-1分子參與了多種Th1/Th2細(xì)胞失衡性自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化癥MS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎EAE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎R(shí)A等）和過(guò)敏性疾?。ㄈ缦?、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性濕疹等）的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。將Tim-1分子大量表達(dá)，將可能成為一種治療這些疾病的基因工程藥物。
　　最近的研究中，在人源化SCID(Severe combined immune deficient disease)小鼠實(shí)驗(yàn)性哮喘

4、模型中，用識(shí)別人Tim1-IgV結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體可以抑制T細(xì)胞的增殖，降低特異性Th2細(xì)胞反應(yīng)，緩解哮喘病情，并起到一定的治療作用。因此，我們?cè)O(shè)想Tim-1和配體結(jié)合的活性區(qū)域主要在胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域。
　　本課題中，我們擴(kuò)增出Tim-1胞外區(qū)的N末端免疫球蛋白Ⅴ區(qū)結(jié)構(gòu)域(IgV)的基因，插入原核表達(dá)載體PET28a，成功的構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒PET28a-Tim-1(IgV)。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，篩選出高表達(dá)

5、Tim-1(IgV)的菌株BL21(DE3)-PET28a-Tim-1(IgV)。
　　表達(dá)的Tim-1(IgV)主要是以包涵體的形式存在。中試發(fā)酵的摸索，進(jìn)一步提高了Tim-1(IgV)的表達(dá)水平。目的蛋白可達(dá)到濕菌的16.7％，得率可達(dá)21.55mg/L。包涵體經(jīng)洗滌，變性，純化，復(fù)性后，純度達(dá)85％以上。通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)，表明Tim-1(IgV)可以有效抑制由anti-CD3 mAb和anti-CD28mAb協(xié)同刺激