結(jié)核桿菌嵌合蛋白Ag856A2的原核表達、純化、抗原性分析及其單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：構(gòu)建結(jié)核桿菌嵌合蛋白Ag856A2的原核表達載體，進行原核表達、純化和抗原性分析，制備該蛋白的單克隆抗體，并鑒定單抗的重要性質(zhì)。 方法：以DNA疫苗HG856A為模板，經(jīng)PCR擴增獲得ag856a2基因，克隆至pET28a質(zhì)粒得到原核表達質(zhì)粒pET856A2；用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)目的基因表達，通過SDS-PAGE鑒定其表達形式；用Ni2+柱親和層析純化嵌合蛋白Ag856A2;分別用Ag

2、85A及ESAT-6的小鼠抗血清對純化的蛋白Ag856A2進行Western Blotting分析其抗原性。用DNA疫苗HG856A和純化的嵌合蛋白Ag856A2免疫BALB/C小鼠，取脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽性克隆，用有限稀釋法將陽性克隆單克隆化，再用間接ELISA法篩選、鑒定，最終建立穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；分別用間接ELISA法鑒定單克隆抗體的亞類、效價及所識別

3、的抗原，用Western Blotting分析識別蛋白ESAT-6的單克隆抗體的特異性。 結(jié)果：成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET856A2，嵌合蛋白Ag856A2以包涵體形式表達，約占菌體總蛋白的35％；經(jīng)Ni2+柱親和純化的樣品SDS-PAGE分析純度在90％以上，Ag85A及ESAT-6抗血清均可與其發(fā)生特異性反應(yīng)。融合后經(jīng)篩選、克隆化得到6株抗Ag856A2的雜交瘤細胞，經(jīng)鑒定有五株可同時與蛋白Ag856A2、Ag85A反應(yīng)，為I

4、gG1亞類；一株可同時與蛋白Ag856A2、ESAT-6反應(yīng)，為IgG2b亞類，其培養(yǎng)上清與蛋白ESAT-6反應(yīng)效價為6400，與蛋白Ag856A2反應(yīng)效價為12800；該株單克隆抗體經(jīng)Western Blotting鑒定可與蛋白Ag856A2、ESAT-6發(fā)生特異性反應(yīng)。 結(jié)論：以包涵體形式表達的嵌合蛋白Ag856A2具有Ag85A及ESAT-6的抗原性；以其DNA疫苗和純化蛋白免疫小鼠后，初步建立起一株分泌抗蛋白ESAT-6