薯蕷皂苷對(duì)牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)理的研究.pdf

1、目的:研究薯蕷皂苷(Dio)對(duì)培養(yǎng)牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAECs)高糖損傷(HG damage)的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.采用機(jī)械刮取法體外培養(yǎng)牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,利用Ⅷ因子相關(guān)抗原,采用免疫組化法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。
　　 2.建立高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型,以薯蕷皂苷進(jìn)行干預(yù)。內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(C)；高糖損傷組(HG)終濃度120mmol/L:薯蕷皂苷低

2、、中、高劑量干預(yù)組(Dio L、M、H+HG)終濃度分別為2、6、10μg/ml。
　　 3.分別觀察各組血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；MTT法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞存活率；硝酸還原酶法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度；硫代巴比妥酸法(TBA法)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量；黃嘌呤氧化酶法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力；苯肼法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞LDH漏出；熒光指示劑測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度[ca2+]i；Western Blot測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的蛋白表達(dá)。
　　

3、 結(jié)果:
　　 1.機(jī)械刮取法培養(yǎng)原代牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞:細(xì)胞呈多角形,核仁顯著,呈圓形或橢圓形。在接種24h后貼壁生長(zhǎng),2～3d有細(xì)胞從組織塊鉆出,10d左右細(xì)胞融合成單層,如“鋪路石”樣鑲嵌排列。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化法檢測(cè),胞漿內(nèi)可見黃綠色顆粒,證明培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、圓縮,胞體變小,細(xì)胞間隙增寬,邊界模糊；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)

4、組細(xì)胞形態(tài)明顯飽滿,圓縮細(xì)胞減少,細(xì)胞間連接增加,邊界變得清楚。
　　 3.內(nèi)皮細(xì)胞存活率:薯蕷皂苷各劑量組單獨(dú)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞存活率無顯著性變化；與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著升高。
　　 4.內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度:硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞NO濃度,與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度顯著降低；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各

5、劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度顯著升高。
　　 5.內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力:黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力,與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力顯著降低；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力顯著提高。
　　 6.內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量:硫代巴比妥酸法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量,與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞M D A含量顯著升高；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量

6、顯著降低。
　　 7.內(nèi)皮細(xì)胞LDH漏出:苯肼法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞LDH漏出,與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組內(nèi)皮細(xì)胞LDH漏出顯著升高；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH漏出顯著降低。
　　 8.內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣濃度[Ca2+]i:熒光指示劑測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度[Ca2+]i,與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣濃度[Ca2+]i顯著升高；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞游離

7、鈣濃度[Ca2+]i顯著降低。
　　 9.內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá):Western blot測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)。與空白對(duì)照組比較,高糖損傷組eNOS蛋白表達(dá)顯著降低；與高糖損傷組比較,薯蕷皂苷各劑量干預(yù)組eNOS蛋白表達(dá)顯著增加。
　　 結(jié)論:細(xì)胞水平證實(shí),薯蕷皂苷對(duì)高糖損傷的培養(yǎng)牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用,保護(hù)機(jī)制可能涉及以下幾方面:
　　 1.通過增加SOD含量,提高細(xì)胞清除氧自由基的能