根皮苷對db-db小鼠主動脈的保護作用機制研究.pdf

1、第一部分根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護作用
　　 研究背景:
　　 糖尿病以慢性血糖水平增高為特征，是一種由于胰島素抵抗伴有相對胰島素不足或胰島素分泌缺陷而導致的代謝性疾病。糖尿病臨床分型主要包括1型和2型糖尿病。其中，2型糖尿病患病率最高，發(fā)病機制最為復雜。過去的20年，隨著人們生活水平的提高、生活方式的改變以及人口的老齡化，2型糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內逐年增加。目前我國已成為糖尿病第一大國。糖尿病威脅人們健康與

2、生命，嚴重影響人類的生活質量，已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問題。長期的高血糖可使一些組織或器官發(fā)生結構改變和功能障礙，導致各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是糖尿病致死和致殘的首要原因。其中大血管病變表現(xiàn)為主動脈、冠狀動脈、腦基底動脈等大、中型血管的動脈粥樣硬化，這些血管的損害是糖尿病心腦血管疾病的病理基礎。糖尿病患者的動脈粥樣硬化相對非糖尿病患者患病率高，發(fā)病年齡早，病情進展快。幾乎超過半數(shù)的2型糖尿病患者最終會并發(fā)

3、糖尿病的大血管病變。但是迄今為止，針對糖尿病大血管病變的防治手段仍然集中于代謝危險因素的控制（如嚴格控制血糖、血脂、血壓），戒煙，血管緊張素轉換酶抑制劑的應用等。然而上述治療方法并不能完全阻斷動脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，深刻理解2型糖尿病及其血管并發(fā)癥的病理生理，開發(fā)研制新型藥物，在積極控制血糖的同時，關注并加強對其血管并發(fā)癥的干預和治療有著極為重要的意義。
　　 根皮苷是一種天然酚類物質，可由蘋果樹的根、皮、莖、嫩葉及果實中提取

4、獲得。研究資料表明，蘋果樹體內酚類物質總含量中，根皮苷占到95％。根皮苷具有多種潛在的功效，包括降血糖，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤等。根皮苷抑制內皮粘附分子和血小板激活，對血管內皮有保護作用。然而，根皮苷對糖尿病的大血管是否有保護作用，目前國內外尚未見報道。本實驗以db/db小鼠作為2型糖尿病動物模型，給予根皮苷干預，觀察根皮苷對2型糖尿病大血管并發(fā)癥的影響，討論可能的作用機制，以探索根皮苷治療糖尿病的可能性，為臨床治療糖尿病大血管并發(fā)癥提

5、供新的思路和途徑。
　　 研究目的:
　　 1.觀察db/db小鼠主動脈組織病理學變化和超微結構變化，以及根皮苷對db/db小鼠主動脈損害的影響。
　　 2.觀察db/db小鼠根皮苷干預對血糖、血脂、甘油三酯、膽固醇、糖基化終末產(chǎn)物、丙二醛、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮等指標的影響，探討根皮苷對db/db小鼠主動脈保護作用的可能的機制及其安全性。
　　 3.研究根皮苷對于STAT3蛋白與p-STA

6、T3蛋白在主動脈組織表達的影響，初步探討根皮苷對db/db小鼠主動脈保護作用的分子機制，為開辟糖尿病大血管病變治療的新途徑完善理論基礎。
　　 研究方法:
　　 7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只以及7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只，均飼喂顆粒飼料，飲水不限，觀察1周進入實驗。16只db/db小鼠隨機分為兩組:一組8只為糖尿病根皮苷干預組(DMT)，每日給予根皮苷(20mg/kg/d)生理鹽

7、水溶液灌胃;另一組8只為糖尿病組(DM)，給予相同體積的生理鹽水灌胃;db/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，給予相同體積的生理鹽水灌胃10周。實驗期間每周定期測量體重(BW)并記錄。于10周末，所有小鼠空腹過夜，10％水合氯醛麻醉后(350mg/kg)，腹主動脈取血處死。留取血清檢測空腹血糖(FBG)，甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、丙二醛(MDA)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(B

8、UN)、肌酐(Cr)等生化指標。留取的主動脈用4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，進行光學顯微鏡及電子顯微鏡檢查。部分主動脈組織分離后速存于液氮，速凍后-80℃保存，用作蛋白質組學實驗。
　　 研究結果:
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長以及精神狀況良好，活躍，毛發(fā)光順。DM組小鼠實驗進程中，逐漸表現(xiàn)為污穢無澤，被毛蓬松，少動，明顯多飲、多食、多尿，體重快速增加。DMT組小鼠上述表現(xiàn)有所減輕。<

9、br>　　 2.體重變化
　　 實驗開始時，DM組和DMT組基礎體重無顯著性差異（P＞0.05），均明顯高于CC組(P＜0.01)。自實驗第2周開始，DM組小鼠體重逐漸增加，該趨勢一直持續(xù)至第10周實驗結束。然而，DMT組小鼠與DM組相比，在實驗的第2、4、6、8、10周體重均明顯降低(P＜0.01)，表明根皮苷能夠顯著改善DM小鼠的體重。
　　 3.FBG、TC、TG、AGEs、MDA、ALT、AST、BUN、Cr含

10、量檢測結果
　　 實驗開始時DM組與DMT組間的FBG、AGEs、MDA水平無顯著性差異（P＞0.05），但與CC組比較，兩組FBG、AGES和MDA水平均明顯升高（P＜0.05）。10周末，DM組小鼠FBG、AGEs和MDA均明顯高于CC組(P＜0.01)，DMT組小鼠FBG、AGEs和MDA顯著低于DM組（P＜0.05）。表明根皮苷顯著降低了FBG、TC、TG、AGEs和MDA水平。ALT、AST、BUN、Cr在各組間無差異

11、。
　　 4.主動脈組織學觀察
　　 正常對照組小鼠主動脈內膜光滑，無異常表現(xiàn)。糖尿病組小鼠主動脈管壁增厚，血管內膜受損，血管平滑肌細胞增殖、移行。根皮苷干預組小鼠比糖尿病小鼠主動脈病變程度減輕。表明根皮苷對糖尿病主動脈有保護作用。
　　 5.根皮苷對db/db小鼠主動脈STAT3蛋白與p-STAT3蛋白表達的影響
　　 蛋白質免疫印跡(Western blotting)染色顯示，10周末，與CC組小鼠主

12、動脈組織p-STAT3蛋白表達相比較，DM組主動脈組織p-STAT3蛋白表達明顯增多。根皮苷治療后，p-STAT3蛋白表達則顯著減少。表明根皮苷對STAT3傳導通路有抑制作用。
　　 結論:
　　 根皮苷能夠有效減輕db/db小鼠體重，減輕主動脈損害。能夠降低小鼠的FBG、改善TC、TG、AGEs、MDA等生化指標，對肝、腎功能無影響。根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護作用與其降糖調脂、降低AGEs水平和抗氧化有關。根皮

13、苷抑制db/db小鼠主動脈STAT3的磷酸化，提示根皮苷可以通過抑制STAT3信號轉導通路發(fā)揮其血管保護作用。
　　 根皮苷為純天然物質，安全，副作用小，能夠減輕2型糖尿病的血管損害，具有降糖調脂、抗氧化等多種功效?？赏鳛橐环N新型的功能成分，為2型糖尿病并發(fā)癥的防治提供新的思路和手段。
　　 第二部分應用iTRAQ技術探討根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護機制
　　 研究背景:
　　 隨著人類基因組工作

14、框架的完成，生命科學的研究進入了后基因組時代?？茖W家逐漸意識到基因只是遺傳信息的載體，而蛋白質才是生命活動的最終執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，介導幾乎所有的生命活動。因此，除了了解蛋白質的數(shù)量、結構和性質以外，全面動態(tài)的了解蛋白質的生物功能及不同蛋白質相互關系的變化，才能直接闡明生理或病理條件下生命活動的變化機制，從而揭示生命活動的規(guī)律和生命現(xiàn)象的本質。因此生命科學的工作重心從獲取生命的全部遺傳信息而漸漸轉移到對生命功能的整體探索上來

15、。對蛋白質組學研究也逐漸成為后基因組研究中的核心內容。
　　 精確鑒定及定量整個細胞基因組所表達的全部蛋白質稱為定量蛋白質組學。定量蛋白質組學的重點是定性定量地解析整個細胞內所有蛋白質的動態(tài)變化，從而反映細胞功能、過程、機制等綜合信息。它是功能蛋白質組學的重要內容，常被用于分析疾病與健康兩種不同狀態(tài)，以及藥物處理前后細胞內差異表達的全體蛋白質。定量蛋白質組學技術可用于鑒定對疾病具有提示或診斷功能的蛋白質，也有助于為疾病的治療發(fā)現(xiàn)

16、具有新功能的靶標蛋白。近年來該領域的相關技術發(fā)展迅速，全新的應用和方法設計正在不斷推進技術創(chuàng)新。最近，同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術聯(lián)合質譜分析，已經(jīng)在探討疾病的發(fā)生機制、尋找疾病標志物、以及不同時段或者不同狀態(tài)的多樣本定量分析等蛋白質組學研究領域得到了很好的應用。
　　 根皮苷是蘋果多酚的重要組成成分，作為一種天然多酚類化合物，廣泛存在于蘋果屬的多種植物中，在根、莖、葉與果實中均有分布。根皮苷具有多種生物活性、和藥

17、理作用，比如清除自由基、抗氧化應激、調節(jié)血糖、保護心血管以及抗腫瘤的作用。最近的體內外實驗表明，根皮苷可以顯著改善糖尿病心肌肥厚、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜早期周細胞損傷等并發(fā)癥。本研究第一部分實驗發(fā)現(xiàn):根皮苷對于db/db小鼠主動脈具有明顯的保護作用。但是迄今為止，根皮苷是通過什么機制及有效靶標蛋白來發(fā)揮對2型糖尿病主動脈的保護效應尚未得到解決。
　　 本研究第二部分應用iTRAQ技術，并利用Turbo SEQUEST軟件與國際

18、蛋白質索引（international protein index，IPI）數(shù)據(jù)庫等生物信息學方法，分離與鑒定正常對照組（CC組），糖尿病組(DM組)與糖尿病根皮苷干預組(DMT組)三組小鼠主動脈組織的差異表達蛋白。目的在于揭示根皮苷對于db/db小鼠主動脈的保護機制，為研發(fā)預防和治療糖尿病大血管并發(fā)癥的有效藥物提供潛在靶標和新的視角。
　　 研究目的:
　　 1.獲得db/db小鼠主動脈組織的全部蛋白質的差異表達情況，

19、進一步了解在糖尿病狀態(tài)下主動脈損傷的蛋白質組學改變。
　　 2.探討db/db小鼠經(jīng)根皮苷治療后主動脈組織的差異表達蛋白，篩選并初步驗證藥物作用的關鍵蛋白與候選靶標，從蛋白質組學角度進一步揭示根皮苷對于糖尿病主動脈的保護機制，為開辟糖尿病大動脈病變的治療新途徑奠定實驗基礎。
　　 研究方法:
　　 CC組、DM組與DMT組三組小鼠中各選取4只小鼠，分離主動脈組織。按照iTRAQ蛋白質組學技術要求的樣本制備標準技術

20、流程，如主動脈組織研磨、切碎、超聲破碎、裂解等提取主動脈總蛋白，并以Bradford蛋白質定量法測定蛋白質濃度，分裝提取樣品，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛「鹘M主動脈總蛋白后，各組上樣20ug樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察各組之間電泳后蛋白點遷移平行度。各組主動脈總蛋白采用FASP酶解得到相應各組肽段。各組取60ug肽段，按照ABI公司說明書操作與標記消化后的各組肽段，依次分別為114標記CC組，116標記DMT組，

21、117則標記DM組。標記結束后利用ABI4800 MALDI-TOF/TOF質譜儀各組均隨機選取一定數(shù)量肽段，并檢測其二級質譜圖中低分子量端是否存在相應質量標記試劑，確定標記成功。將各組已標記的肽段混合，然后用Agilent HPLC1200強陽離子交換柱(strong cation exchange，SCX)進行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并成10組，之后予以C18 Cartridge(Sigma)脫鹽，進行下一步質譜鑒定。本研究

22、第二部分使用Thermo Finnigan LTQVelos質譜儀進行液相質譜-串聯(lián)質譜分析(LC-ESI-MS/MS)。質譜儀在線配備0.15mm*150mm C-18反相色譜柱(RP-C18 Column Technology Inc)，液相A液為0.1％甲酸水溶液，B液為0.1％甲酸乙腈水溶液（乙腈為84％）。質譜的進樣方式為采用微毛細管上樣，溫度為200度，檢測方式為正離子。一次全掃描后收集5個碎片圖譜來獲得多肽和多肽碎片的m/

23、z比。原始文件用iTRAQ Result MultipleFile Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用Sequest軟件鑒定多肽分子。最后，使用相關軟件將定量及檢定結果進行合并處理，得到定量和鑒定結果。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析，采用軟件計算的ratio_biweight值作為蛋白質定量結果，以114標記為內參。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為ipi.MOUSE.v3.72.REVERS

24、ED.fasta蛋白庫(Sequest結果過濾參數(shù)為:Protein FDR≤0.01;Peptide FDR≤0.01)。應用EXPASY蛋白質組學工具分析等電點、分子量等。并采用基因本體論GO(http://www.geneontology.org)對經(jīng)鑒定的主動脈組織蛋白質進行分類。分別從細胞組成、分子功能及生物過程對蛋白質表達譜進行定位分類與功能分析。選取兩個差異表達的關鍵蛋白經(jīng)Western blotting來驗證其在糖尿病小

25、鼠主動脈組織中的表達情況。
　　 研究結果:
　　 1.小鼠主動脈組織總蛋白SDS-PAGE結果
　　 結果提示各組主動脈SDS-PAGE蛋白質點遷移條帶清晰，各組間平行度較好，可以進行下一步實驗。
　　 2.iTRAQ標記統(tǒng)計學驗證
　　 本部分以114標記的正常組小鼠主動脈蛋白樣品做為對照，將117標記的糖尿病組小鼠和116標記的根皮苷治療組小鼠主動脈蛋白樣品與對照的比值進行統(tǒng)計分析。結果顯示

26、幾種標記試劑進行的蛋白標記實驗均一性好，并提示10％的蛋白有顯著性差異，符合統(tǒng)計學的規(guī)律。
　　 3.質譜數(shù)據(jù)解析結果
　　 本研究使用高效液相色譜分離與電噴霧-串聯(lián)質譜分析(LC-ESI-MS/MS)在線獲取的MS/MS原始質譜數(shù)據(jù)，采用Turbo SEQUEST程序自動進行非冗余IPI小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定到的唯一肽段15825條，共有3083種蛋白質，其中有定量信息的蛋白有1512種（過濾參數(shù):蛋白質FDR≤0

27、.01;肽段FDR≤0.01）。
　　 本研究中，以114標記的正常組小鼠主動脈蛋白樣品做為對照，將117標記的糖尿病組小鼠和116標記的根皮苷治療組小鼠主動脈蛋白樣品與對照的比值進行統(tǒng)計分析。比值小于0.67或大于1.5的蛋白即為根皮苷治療(20 mg/kg/day)10周后表達明顯下調或者上調的主動脈組織蛋白。與正常對照小鼠組相比，DM組主動脈的差異表達蛋白557個，其中，表達增高的點463個，降低的點94個。另外，與非治療

28、組相比，糖尿病小鼠經(jīng)根皮苷治療后主動脈有70個差異表達蛋白的表達水平恢復，其中50個蛋白的表達降低，20個蛋白表達增高。
　　 4.根皮苷干預后主動脈差異蛋白質的定位分析
　　 應用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)的GO分析以及相關文獻，對糖尿病小鼠主動脈差異表達的70個蛋白分析進行定位分類。主動脈差異表達蛋白中胞漿蛋白比例最大，占23.08％。其次是核蛋白和膜蛋白，分別占15.3

29、8％和13.9％，線粒體蛋白和高爾基結構蛋白均占8.79％，內質網(wǎng)蛋白占7.69％，另外還有少量核糖體蛋白和溶酶體蛋白，分別占2.20％和1.10％。
　　 5.根皮苷干預后主動脈差異蛋白質的功能分析
　　 利用GO分析結合UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫以及相關文獻，將LC-ESI-MS/MS鑒定得出的根皮苷干預后的70個主動脈差異蛋白點進行功能分析。差異蛋白中的與三大物質代謝相關的蛋白所占比例最大，達到17.28％。其次是結

30、合蛋白，達到16.05％。參與氧化應激和ATP合成的蛋白占11.11％。介導細胞凋亡、參與細胞周期調控及增殖的蛋白占9.88％。結構蛋白和信號轉導蛋白分別占8.64％和4.94％。
　　 6.Westem blotting驗證差異蛋白在主動脈組織的表達改變
　　 我們采用Westem blotting的方法選擇STEAP4和PDE5A兩個蛋白來驗證iTRAQ聯(lián)合LC-ESI-MS/MS鑒定的差異蛋白的結果的可靠性。與正常

31、對照組比較，db/db小鼠主動脈STEAP4和PDE5蛋白表達明顯增加;根皮苷治療10周后，糖尿病主動脈STEAP4和PDE5蛋白表達顯著降低。因此，經(jīng)Western blotting驗證重點選取的差異蛋白STEAP4和PDE5A在主動脈組織上的表達與iTRAQ技術獲得的蛋白質組學結果相符合，說明iTRAQ技術的實驗結果真實可靠。
　　 結論:
　　 1.iTRAQ技術能夠同時對多組樣本進行比較分析，可以獲得更好的蛋白質

32、組覆蓋率。iTRAQ技術用于研究根皮苷對db/db小鼠主動脈保護作用的分子機制有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標。
　　 2.應用LC-ESI-MS/MS鑒定得到根皮苷干預db/db小鼠主動脈差異表達蛋白70個，其中下調點50個點，上調點20個，其功能涉及到細胞代謝、氧化應激、信號轉導、細胞骨架、細胞周期及細胞凋亡等，提示這些過程與機制可能參與了糖尿病主動脈病變的發(fā)生與發(fā)展。
　　 3.Western blotting證實db/db