重組人生長激素干預(yù)GHR不同表達水平人肝癌細胞的實驗研究.pdf

1、目的：體外環(huán)境下，觀察重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)對生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)不同表達狀態(tài)的人肝癌細胞系增殖、凋亡及其胞膜表面GHR密度變化的影響，對與肝癌細胞同環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)增殖的影響，并初步探索相關(guān)機理。
　　 方法：利用體外培養(yǎng)的Bel—7402、HepG2、SMMC7721、QGY—7701、

2、Bel—7405和HCCLM3六種肝癌細胞，和人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304，用免疫細胞化學(xué)法檢測人肝癌細胞系表面GHR的表達。然后把各肝癌細胞系分三組：對照組、rhGH濃度50ng/ml的rhGH1組和250ng/ml的rhGH2組；通過ELISA法、四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法、流式細胞術(shù)及熒光染色等手段，觀察rhGH對肝癌細胞細胞生長、凋亡、細胞周期比例、IGF—1分泌等的影響；再設(shè)立ECV304單獨培養(yǎng)組、SMMC—7721/

3、ECV304共培養(yǎng)組和Bel—7402/ECV304共培養(yǎng)組。用上述干預(yù)方法/和聯(lián)合貝伐單抗干預(yù)，描繪ECV304細胞生長曲線和流式細胞儀檢測ECV304周期比例。分別單獨培養(yǎng)SMMC—7721、Bel—7402，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT—PCR)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定肝癌細胞VEGF mRNA表達和蛋白分泌情況；最后選取HepG—2、SMMC7721、和QGY—7701，每株細胞四種處理：未處理組，50ng/mlrh

4、GH干預(yù)組，100ng/mlrhGH干預(yù)組，200ng/mlrhGH干預(yù)組。采用流式、放射性受體分析方法檢測rhGH處理后細胞膜表面GHR的表達情況的變化情況。同時行四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)熒光染色、ELISA法分析不同濃度rhGH對人肝癌細胞系的細胞生長、增殖、IGF—Ⅰ分泌等的影響。
　　 結(jié)果：Bel—7402、HepG2細胞過表達GHR，與對照組相比，rhGH體外明顯促其

5、分裂增殖，IGF—1分泌量增加(P<0．05)，且與rhGH濃度無關(guān)。SMMC7721可疑表達GHR，QGY—7701、Bel—7405和HCCLM3細胞均不表達GHR，rhGH對其細胞分裂增殖及IGF—1分泌變化均無明顯影響(P>0．05)；與Bel—7402、SMMC7721分別共培養(yǎng)ECV304細胞與單獨培養(yǎng)的ECV304細胞相比，生長速度加快，倍增時間縮短，S期升高(P<0．05)。與對照組比較，rhGH促Bel—7402的VE

6、GF mRNA表達及蛋白分泌水平均增加，并且與ECV304共培養(yǎng)時細胞S期比例顯著升高，且呈rhGH濃度依賴(P<0．05)，卻未引起細胞株SMMC—7721發(fā)生相應(yīng)變化(P>0．05)。貝伐單抗封閉VEGF，所有實驗組均出現(xiàn)ECV304增殖參數(shù)下調(diào)(P<0．05)，聯(lián)合高濃度rhGH無法逆轉(zhuǎn)；50、100、200ng/ml rhGH干預(yù)后，流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞胞膜表面GHR密度，熒光強度較未處理組明顯增加(P<0．05)，放射

7、性受體分析法檢測其胞膜表面GHR位點數(shù)分別為：8．4350±0．2396、9．3957±0．5143、8．3297±0．3133(10^3/cell)，較空白對照組7．5137±0．5352(10^3/cell)明顯增加(P<0．05)；與未處理組比，rhGH干預(yù)細胞株SMMC7721及QGY—7701，均未引起胞膜表面GHR密度變化。
　　 結(jié)論：體外環(huán)境下，rhGH可致過量表達GHR的人肝癌細胞株生長加速、提高其胞膜GHR密