T細(xì)胞免疫衰老對破骨細(xì)胞增殖分化的影響及右歸丸的逆轉(zhuǎn)效應(yīng).pdf

1、目的：
　　隨著老齡化社會的到來，自身免疫病、骨代謝性疾病等免疫衰老相關(guān)疾病已成為威脅老年健康的重要因素，骨代謝異常引發(fā)的骨破壞是免疫衰老相關(guān)疾病的重要特征之一。減低這類疾病的危害，必需重視改善免疫衰老狀態(tài)。T細(xì)胞亞群失衡是免疫衰老的核心，增齡與炎癥刺激的日積月累使T細(xì)胞表型與功能的多樣性、可塑性和均衡性受到破壞，并直接威脅骨免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，造成破骨細(xì)胞（Osteoclast，OC）的異?；罨凸橇縼G失，導(dǎo)致骨代謝性疾病，如骨質(zhì)

2、疏松癥及炎癥性骨丟失等。因此，保護(hù)T細(xì)胞庫的多樣性和可塑性、重建T細(xì)胞亞群平衡可恢復(fù)免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、改善骨微環(huán)境，防治骨代謝疾病。
　　我們以往在研究發(fā)現(xiàn)：右歸丸(You-Gui-Wan, YGW)及部分有效成分可調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分化發(fā)育和效應(yīng)極化，對由激素誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫衰老有明顯的保護(hù)作用，部分成分可提高初始T細(xì)胞含量，提高機(jī)體對抗新抗原刺激的能力。這些藥物在逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞異常分化的同時(shí)是否能改善破骨細(xì)胞的異常分化是我們關(guān)注的焦點(diǎn)。

3、在此基礎(chǔ)上，探討T細(xì)胞的免疫衰老程度與骨代謝異常的相關(guān)性，并以YGW及部分有效成分的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制為依據(jù)，尋找抗T細(xì)胞免疫衰老、防治骨代謝疾病的藥理機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥改善免疫衰老、防治骨相關(guān)疾病提供新策略。
　　方法：
　　1.中藥YGW制劑的制備：根據(jù)YGW經(jīng)典配方組成配伍中藥，采用傳統(tǒng)水提醇沉方法制備該復(fù)方制劑。YGW部分有效成分選用君臣藥物的有效成分烏頭堿（aconitine, AC）、梓醇（catapol,

4、CA）、桂皮醛（cinnamaldehyde, CI）。
　　2. T細(xì)胞免疫衰老模型的建立及中藥制劑的干預(yù)方法：采用激素法誘導(dǎo)建立T細(xì)胞免疫衰老小鼠模型；模型小鼠的中藥治療分為四組，分別采用腹腔注射CA組(6mg·kg-)、CI組(0.126mg·kg-)、AC組(10μg·kg-)和YGW組(7.5g·kg-)灌胃治療組。
　　3.采用Annexin V/PI雙染法檢測各組小鼠胸腺細(xì)胞凋亡狀態(tài)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)

5、檢測小鼠外周血、脾臟、骨髓中初始 T細(xì)胞（ na?ve T cell, Tn, CD3+CD45RA+CD62L+）和中央型記憶性 T細(xì)胞（ central memory T cell, TCM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L+）效應(yīng)性記憶 T細(xì)胞（effector memory T cell, TEM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L-）比例，分析CD4+/CD8+的變化。
　　5.采用流式細(xì)胞胞內(nèi)外因

6、子雙染法檢測 T細(xì)胞亞群 Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)及Treg(CD4+CD25+foxp3+)的效應(yīng)極化狀態(tài)及RANKL（CD3+RANKL+）的表達(dá)。
　　6.采用HE染色觀察小鼠骨形態(tài)學(xué)變化，
　　7. ELISA法檢測小鼠血清中破骨細(xì)胞活性相關(guān)TRACP5b的表達(dá)水平
　　8. Western blot技術(shù)檢測藥物處理前

7、后骨髓細(xì)胞TRAF6、P38、MEK等破骨細(xì)胞分化相關(guān)信號分子的表達(dá)水平。
　　9. MTT法檢測激素處理前后破骨細(xì)胞的增殖能力以及右歸丸及部分有效成分的直接作用。
　　10. RT-PCR技術(shù)檢測破骨細(xì)胞RANK、NFATc1 mRNA的表達(dá)水平，以及右歸丸及部分有效成分的直接作用。
　　結(jié)果：
　　1.激素誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞免疫衰老狀態(tài)
　　激素誘導(dǎo)的衰老模型小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)，胸腺細(xì)

8、胞凋亡率升高(P<0.01)；外周血、脾臟、骨髓中Tn比例下降(P<0.05)； TCM比例降低(P<0.05)，而效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM)比例上升(P<0.05)；CD4/CD8的比值降低(P<0.05)； Th1細(xì)胞亞群分泌IFNr的能力下降、Th2比例無明顯變化、Th17比例升高、Treg細(xì)胞比例降低，Th1/Th2的比值下降、Th17/Treg比值升高(P<0.05)；T細(xì)胞亞群處于失衡狀態(tài)，是激素誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫衰老的典型模式。

9、
　　2.激素誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞免疫衰老狀態(tài)對骨代謝的影響
　　伴隨著T細(xì)胞亞群的改變，骨髓細(xì)胞明顯減少，骨髓微環(huán)境中Tn減少，Th1細(xì)胞比例下降，而Th17比例升高，T淋巴細(xì)胞RANKL表達(dá)升高，骨組織骨陷窩增大，骨小梁面積減少(P<0.05)；并且血清中破骨細(xì)胞相關(guān)抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP5b）水平顯著升高(P<0.05)，T細(xì)胞亞群失衡與骨代謝異常伴隨發(fā)生。
　　3.右歸丸及部分有效成分顯著逆轉(zhuǎn)激素誘導(dǎo)的T

10、細(xì)胞免疫衰老狀態(tài)
　　與激素誘導(dǎo)的衰老模型小鼠相比，YGW及部分有效成分可明顯抑制小鼠胸腺細(xì)胞的的過度凋亡、提高外周免疫器官Tn的比例(P<0.05)；TCM比例升高(P<0.05)，TEM比例相對下降(P<0.05)；上調(diào)CD4/CD8細(xì)胞的比值，增強(qiáng)脾臟Th1亞群細(xì)胞IFN-γ的分泌能力，上調(diào)Th1/Th2比值，(P<0.05)，降低Th17亞群細(xì)胞比例，而調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞亞群比例有所升高，使Th17/Treg比值有所恢復(fù)(

11、P<0.05)，改善了激素誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)。
　　4.右歸丸及部分有效成分顯著逆轉(zhuǎn)骨髓微環(huán)境中T細(xì)胞亞群失衡
　　與激素誘導(dǎo)的衰老模型小鼠相比， YGW及部分有效成分可提高骨髓 Tn的比例(p<0.05)；增強(qiáng)骨髓 Th1亞群細(xì)胞 IFN-γ的分泌能力，降低 Th17亞群細(xì)胞比例，降低RANKL的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)骨微環(huán)境中激素誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)。
　　5.右歸丸及部分有效成分對激素誘導(dǎo)骨代謝異常的保護(hù)作用

12、>　　骨組織HE染色結(jié)果顯示：YGW及其有效成分均能抑制激素誘導(dǎo)的骨小梁的面積減少，保護(hù)激素誘導(dǎo)的骨丟失，同時(shí)，降低血清中TRACP5b的表達(dá)水平。TRAF6分子的表達(dá)(P<0.05)，減弱MAPK信號通路的活化，從而抑制破骨細(xì)胞的成熟。
　　6.右歸丸及部分有效成分體外對激素誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞異常分化的直接作用
　　MTT結(jié)果顯示：YGW及部分有效成分能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的增殖，藥效呈時(shí)間劑量依賴性；同時(shí)，高濃度 YGW及部分

13、有效成分能夠降低破骨細(xì)胞分化特異性基因RANK、NFATc1 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1.激素誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫衰老狀態(tài)突出特征是：Tn、TCM細(xì)胞的比例降低，TEM細(xì)胞比例相對升高，CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg亞群之間的比例失衡，骨髓T細(xì)胞RANKL表達(dá)升高。
　　2.右歸丸及部分有效成分對激素誘導(dǎo)的 T細(xì)胞免疫衰老有明顯的保護(hù)作用，可顯著提高Tn、TCM細(xì)胞的比例，降低TEM細(xì)胞比

14、例，重建脾臟和骨微環(huán)境CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg各亞群之間的平衡，同時(shí)降低骨髓T細(xì)胞RANKL的表達(dá)。
　　3.右歸丸及部分有效成分能夠降低血清中TRACP5b的表達(dá)，抑制激素誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收活性的增強(qiáng)，改善骨質(zhì)。
　　4.右歸丸及部分有效成分逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞免疫衰老誘導(dǎo)的OC異常分化其作用機(jī)制可能是通過抑制MAPK信號通路中MEK和P38的活化，從而抑制了OC的分化和成熟。
　　5.右歸丸及部分