夏枯草三萜類的肺癌化學(xué)預(yù)防機(jī)制研究.pdf

1、肺癌的發(fā)生及死亡率居各類惡性腫瘤的首位。由于肺癌不易早期發(fā)現(xiàn)及治療的高難度，因此，預(yù)防肺癌的發(fā)生，對(duì)降低肺癌發(fā)生率及死亡率具有舉足輕重的作用。中醫(yī)的“治未病”預(yù)防疾病思想與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的化學(xué)預(yù)防異曲同工，其目的均是用藥物減少肺癌的發(fā)生率。夏枯草PrunellavulgarisL.為唇形科植物，性苦寒，具清熱解毒之功效，其成分主要包括三萜類、酚酸類、黃酮類、多糖等成分，具有確切的防治肺癌療效，在臨床上廣泛使用。
　　 Nrf2/AR

2、E信號(hào)通路是干預(yù)癌癥發(fā)生的重要信號(hào)通路，它對(duì)細(xì)胞抵御外源有害物質(zhì)以及氧化應(yīng)激有著重要作用。本課題研究以中醫(yī)藥治未病思想為指導(dǎo)，以夏枯草為模型藥物，引進(jìn)、消化再創(chuàng)新，通過Nrf2信號(hào)通路，從整體動(dòng)物水平、細(xì)胞水平、分子蛋白水平，研究夏枯草防治肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。主要內(nèi)容：
　　 1.三萜類組分的富集分離
　　 提取不同批次的夏枯草三萜，然后利用大孔樹脂得到三萜類成分，建立人肺腺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1體外藥效

3、篩選體系，對(duì)夏枯草進(jìn)行了活性篩選評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示江蘇產(chǎn)夏枯草得到的三萜對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用最好，對(duì)A549、SPC-A-1的IC50分別為278.17，356.73μg/mL。
　　 2.夏枯草三萜化學(xué)預(yù)防肺癌的模型建立
　　 ①人肺癌細(xì)胞模型的建立：
　　 建立肺癌細(xì)胞A549及SPC-A-1細(xì)胞模型，采用MTT法，以細(xì)胞增殖抑制率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)夏枯草三萜抗肺癌的效果，結(jié)果顯示夏枯草三萜類對(duì)A549及SPC-A-1

4、的IC50分別為278.17，356.73μg/mL。說明夏枯草對(duì)肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)抑制作用，其中A549細(xì)胞對(duì)夏枯草更為敏感。結(jié)果表明所建立的細(xì)胞模型能有效地應(yīng)用于活性篩選。
　　 ②人正常支氣管上皮細(xì)胞模型的建立：
　　 建立人正常支氣管上皮細(xì)胞NormalHumanbronchialepithelialcells(NHBE)的體外藥效篩選體系，采用MTT法，以細(xì)胞增殖抑制率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)夏枯草三萜抗肺癌的效果，結(jié)果顯示

5、夏枯草三萜類對(duì)NHBE的IC50為509.82μg/mL，說明夏枯草對(duì)正常細(xì)胞的抑制作用較肺癌細(xì)胞小。建立的生物化學(xué)預(yù)篩體系能有效篩出潛在的防治藥物。
　　 ③香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞模型建立：
　　 建立香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NHBE細(xì)胞在10％香煙煙霧提取物處理24h后，其抑制率為30.12±2.7％，而同時(shí)加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草后，抑制率為26.67

6、±1.4％、22.47±2.2％、19.39±2.3％、21.19±2.5％；CSE對(duì)NHBE有毒害作用，隨濃度增加而增大。結(jié)果表明所建立的模型能反映夏枯草減少誘導(dǎo)物的損傷。
　　 ④整體動(dòng)物模型的建立：
　　 建立了KM小鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，夏枯草可以顯著提高KM小鼠體內(nèi)Ⅱ相解毒酶GST、NQO1活力與GSH含量，用5g生藥/kg/d與10g生藥/kg/d濃度連續(xù)灌胃一周，夏枯草低劑量組的KM小鼠體內(nèi)NQO1、GST

7、酶活力及GSH含量分別為空白對(duì)照組的1.20±0.23倍、1.75±0.37倍、5.67±0.45倍，夏枯草高劑量組的KM小鼠體內(nèi)NQO1、GST酶活力及GSH含量分別為空白對(duì)照組的1.38±0.37倍、2.42±0.26倍、11.13±0.33倍；
　　 建立裸鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，夏枯草可以顯著降低裸鼠的瘤大小，抑瘤率：夏枯草高劑量組89％，夏枯草低劑量組68％；
　　 建立A/J小鼠模型，結(jié)果表明，夏枯草可以顯著降

8、低A/J小鼠肺部腫瘤數(shù)，提高A/J小鼠的脾臟指數(shù)，與對(duì)照組比均有顯著性差異(p<0.05)。結(jié)果表明所建立的整體動(dòng)物模型能客觀地反映夏枯草預(yù)防肺癌的活性。
　　 3.夏枯草三萜類化學(xué)預(yù)防肺癌的機(jī)制研究
　　 ①夏枯草對(duì)NHBE細(xì)胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表達(dá)的影響：
　　 在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生藥濃度下，NHBE細(xì)胞內(nèi)GST酶活力分別為100.21±5.11％、125.38±4.

9、42％、136.48±3.96％、156.19±4.88％，NQO1酶活力分別為100.72±6.13％、113.25±4.92％、139.53±5.35％、146.81±4.27％，GSH含量分別103.37±4.86％、110.52±5.13％、125.94±5.87％、133.68±5.26％，與CSE組比均有顯著性差異(p<0.05)。westernblot顯示夏枯草可以顯著提高A549細(xì)胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表達(dá)。

10、結(jié)果表明夏枯草可以提高肺正常細(xì)胞NHBE中的Ⅱ相解毒酶活力及表達(dá)，提高對(duì)外界刺激的抵御。
　　 ②siRNA研究Nrf2信號(hào)通路在夏枯草三萜保護(hù)細(xì)胞中作用：
　　 成功建立Nrf2沉默的NHBE細(xì)胞，在正常條件下，GSTPI與NQO1蛋白表達(dá)均有明顯降低，加入CSE未能引起GSTPI與NQO1的過表達(dá)，同時(shí)加入夏枯草三萜也未能有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，表明夏枯草三萜是通過Nrf2信號(hào)通路起保護(hù)細(xì)胞作用。
　　 ③夏枯

11、草對(duì)香煙煙霧提取物細(xì)胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表達(dá)的影響：
　　 NHBE細(xì)胞在10％CSE處理24h后，GSH含量降低為對(duì)照組的35.65±6.33％，GST活力升高為對(duì)照組的1.75±0.042倍，NQO1活力升高為對(duì)照組的2.14±0.037倍，
　　 加入125μg/mL的夏枯草后，GSH含量提高到對(duì)照組72.61±5.29％，GST活力降低到對(duì)照組1.4±0.059倍，NQO1活力降低到對(duì)照組1.5±

12、0.049倍，與CSE組比均有顯著性差異(p<0.05)。
　　 ④熊果酸對(duì)香煙煙霧提取物細(xì)胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表達(dá)的影響：
　　 在10％CSE與25μmol/L濃度熊果酸共同作用下，細(xì)胞內(nèi)GSH含量為空白對(duì)照組的68.53±5.33％，GST活力為空白對(duì)照組的1.32±0.036倍，NQO1活力為空白對(duì)照組的1.55±0.058倍，與CSE組比均有顯著性差異(p<0.05)，且可以減少CSE引起的細(xì)胞

13、DNA損傷，westernblot顯示熊果酸可以顯著提高A549細(xì)胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果表明熊果酸是夏枯草三萜中有效成分之一。
　　 4.夏枯草三萜類對(duì)肺癌細(xì)胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表達(dá)的影響：
　　 在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生藥濃度下，A549中NQO1酶活力分別為73.21±6.33％、79.34±7.86％、72.38±5.55％、61.92±4.28％，GSH

14、含量分別為57.44±4.86％、27.23±5.92％、21.76±5.03％、18.40±4.22％，SPC-A-1細(xì)胞中NQO1酶活力分別為91.09±5.34％、96.42±3.79％、74.57±4.39％、65.78±5.18％，GSH含量分別為52.53±3.18％、25.24±4.82％、20.19±4.76％、17.32±3.92％，與對(duì)照組比均有顯著性差異(p<0.05)，westernblot顯示夏枯草可以顯著降低

15、A549細(xì)胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表達(dá)。夏枯草可以降低肺癌細(xì)胞A549中的Ⅱ相解毒酶活力及表達(dá)，降低對(duì)外界刺激的抵御。
　　 結(jié)論：不同產(chǎn)地、不同品種夏枯草屬藥材其內(nèi)在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)存在本質(zhì)區(qū)別。夏枯草三萜對(duì)正常細(xì)胞的抑制率較肺癌細(xì)胞低。10％CSE作用24h情況下，NHBE細(xì)胞抑制率約為30％，而加入125μg/mL夏枯草三萜會(huì)使抑制率降低至80％，說明夏枯草具有細(xì)胞保護(hù)作用。夏枯草三萜可以顯著減少苯并芘誘導(dǎo)的A/J