夏枯草物質(zhì)基礎構成三萜組分防治肺癌作用與機制研究.pdf

1、肺癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤的首位。肺癌難以早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，而很多病例一經(jīng)臨床發(fā)現(xiàn)，即已進入中晚期，因此，對肺癌進行防治，降低肺癌的發(fā)生率和延緩肺癌的進一步發(fā)展具有重要作用。中醫(yī)“治未病”思想與現(xiàn)代醫(yī)學中的化學預防異曲同工，其目的均是用藥物阻斷和逆轉(zhuǎn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展。夏枯草(Prunellavulgaris.L)為唇形科植物，性苦寒，具清熱解毒之功效，其化學成分主要包括三萜類、黃酮類、酚酸類、多糖類等成分，防治肺癌的療效確切，并在

2、臨床上廣泛使用。
　　 肺癌發(fā)生、發(fā)展對肺癌的防治具有重要作用。本課題研究以中醫(yī)藥“治未病”的思想為指導，以夏枯草三萜組分組分為模型藥物，從整體細胞水平、分子蛋白水平，研究夏枯草防治肺癌的物質(zhì)基礎及其作用與機制。主要內(nèi)容:
　　 1.夏枯草三萜組分組分的富集分離
　　 用70％乙醇提取夏枯草，大孔樹脂和自動純化系統(tǒng)分離純化和富集三萜類組分;采用UPLC對分離過程中的各個樣品進行表征;建立人肺腺癌A549細胞體外藥

3、效篩選體系，評價所得夏枯草三萜組分組分防治肺癌活性。研究結果表明:UPLC檢測自動純化后的1號樣品為夏枯草三萜組分，其對A549的IC50為125.30μg/mL。
　　 2.夏枯草三萜組分防治肺癌作用研究:
　　 (1)夏枯草三萜組分對人肺腺癌A549細胞線粒體膜電位的影響:
　　 研究夏枯草三萜組分對A549細胞線粒體膜電位的作用。夏枯草三萜組分作用A549細胞24h，線粒體膜電位差呈上升趨勢，當夏枯草三萜組

4、分的濃度達到400μg/ml時，線粒體膜電位與空白組相比，顯著性升高（*P＜0.05）。實驗結果表明，夏枯草三萜組分可以通過改變線粒體膜電位誘導肺癌A549細胞凋亡。
　　 (2)夏枯草三萜組分對人肺腺癌A549細胞中凋亡相關蛋白的影響:
　　 夏枯草三萜組分可以促進凋亡蛋白的表達。夏枯草三萜組分作用于A549細胞24h后，westernblot結果顯示，夏枯草三萜組分能顯著性增加促凋亡蛋白cleaved-caspase

5、3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、Bax的表達（*P＜0.05，**P＜0.01）;顯著性降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(*P＜0.05)。結果表明夏枯草三萜組分可以誘導肺癌A549細胞凋亡，對防治肺癌具有重要意義。
　　 (3)夏枯草三萜組分對CSE誘導的NHBE細胞周期的影響
　　 建立香煙誘導模型，考察夏枯草三萜組分防治肺癌的作用。夏枯草三萜組分作用于CSE誘導的NHBE細胞后

6、24h后，采用流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)G1期細胞從79.22％下降到49.52％，S期細胞從7.52％上升到45.63％，說明夏枯草三萜組分能夠有影響CSE誘導的NHBE細胞周期中的G1/S調(diào)控點，使NHBE細胞進入S期進行DNA復制，從而起到預防腫瘤的作用。
　　 (4)夏枯草三萜組分對CSE誘導的NHBE細胞凋亡的影響:
　　 建立香煙誘導模型，考察夏枯草三萜組分防治肺癌的作用。夏枯草三萜組分作用于CSE誘導的N

7、HBE細胞后24h后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)凋亡率從從19.41％下降到12.48％。說明夏枯草三萜組分可以阻止人正常肺支氣管上皮細胞凋亡，從而預防肺癌的發(fā)生。
　　 3.夏枯草三萜組分防治肺癌的機制研究
　　 (1)夏枯草三萜組分對CSE誘導的NHBE細胞中抗氧化指標的影響
　　 細胞內(nèi)的抗氧化酶具備清除自由基，提高胞內(nèi)抗氧化水平，減少氧化損傷的作用。夏枯草三萜組分可以恢復細胞中SOD、CAT、MD

8、A和GSH的水平，達到抗氧化的結果。研究結果說明所建立的抗氧化模型能有效反映夏枯草三萜組分的抗氧化能力，所建立的模型能為防治肺癌的抗氧化機制評價提供方法。
　　 (2)夏枯草三萜組分對CSE誘導的NHBE細胞中抗炎指標的影響
　　 以VE為陽性藥，探討夏枯草三萜組分對細胞炎性指標COX-2和ICMA-1的影響，發(fā)現(xiàn)其能顯著性降低CSE誘導的COX-2和ICMA-1的表達，使其接近于正常水平，揭示其防治肺癌的機制和COX-

9、2和ICMA-1的表達有關。研究結果表明所建立的體外抗炎模型能有效地、客觀地評價夏枯草三萜組分的抗炎能力，為防治肺癌的機制研究殿下實驗基礎。
　　 (3)夏枯草三萜組分對Ⅱ相酶的調(diào)控作用機制研究
　　 以NHBE細胞和昆明小鼠為模型，研究夏枯草三萜組分對Ⅱ相酶的調(diào)控機制。實驗結果發(fā)現(xiàn)夏枯草三萜組分可以引起NHBE細胞和KM小鼠的應激性，啟動自我防護機制，具體表現(xiàn)為提高NQO1和Nrf2蛋白的表達，繼而提高Ⅱ相解毒酶NQO

10、1和GST的活力及表達，提高GSH的含量，說明夏枯草三萜組分通過對Ⅱ相解毒酶的調(diào)控來實現(xiàn)對肺癌的化學預防。
　　 結論:夏枯草用70％乙醇提取，用大孔樹脂和自動純化系統(tǒng)進行分離和純化和富集，得到純度較高的夏枯草三萜組分。夏枯草三萜組分對NHBE細胞的抑制率較A549人肺腺癌細胞低。CSE可以引起NHBE細胞損傷，并且具有濃度依賴性，在10％CSE作用24h的情況下，對NHBE細胞的抑制率約為30％，當加入200μg/mL夏枯草三

11、萜組分會可以使其抑制率降低至13.67±1.4％，說明夏枯草三萜組分具有保護正常細胞的作用。夏枯草三萜組分通過升高A549細胞的線粒體跨膜電位，促進caspase3、caspase8、caspase9蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax的比例，誘導肺癌A549細胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。在CSE誘導的NHBE細胞模型中，夏枯草三萜組分可以調(diào)控NHBE細胞的細胞周期，使G1期細胞從79.22％下降到49.52％，S期細胞從7.52％上升到45.