IPS細胞聯(lián)合VEGF基因治療糖尿病性勃起功能障礙的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　由于飲食結構的變化,人們生活水平的不斷提高,肉類等高脂,高蛋白進食過多，體力活動減少導致的肥胖是2型糖尿病最主要的環(huán)境因素，所以近些年以糖尿病(Diabetes mellitus,DM)為代表的代謝性疾病患病率有逐年上升的趨勢，其中以男性糖尿病患者并發(fā)勃起功能障礙（Erectile dysfunction,ED)的發(fā)病率就顯著高于普通人群。陰莖血管內皮損傷是勃起功能障礙的主要機制[1]，男性糖尿病患者由于陰莖血管內

2、皮比正常人更容易受損而導致糖尿病性勃起功能障礙(diabeticerectile dysfunction，DED)有較高的發(fā)病率[2]。DED目前還沒有很好的治療方法，比較常用的藥物有5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑如他達拉非等,目前統(tǒng)計來看有效率僅為一半左右[3]。還有一些其它療法,如陰莖海綿體內或尿道內注射PGEI（前列腺激素的）等藥物，但是因為療效不能持久，需要反復、頻繁局部注射，并發(fā)癥較多，所以難以推廣應用；也有使用手術治療方法

3、如陰莖假體植入術等治療該病,但由于假體價格過高，且存在感染風險等，并發(fā)癥較多[4]。因此，目前還沒有一種公認的有效的方法來治療糖尿病性勃起功能障礙(diabeticerectile dysfunction，DED),所以尋找DED的治療方法是今年男科領域研究的熱點之一，基因治療是一種潛在的治療方法。本課題中我們從糖尿病性勃起功能障礙發(fā)病的病因入手設計治療方法。探討基因修復陰莖血管內皮功能的可能性。有部分研究針對基因來治療DED作了許多嘗

4、試并取得了一些效果，如Dall等[3]證實VEGF基因能改善DED大鼠的勃起功能；但是基因治療最大的局限
　　在于其載體,如何讓目的基因在需要治療的地方進行表達是關鍵，目前采用的方法有采用病毒載體把目的基因帶入體內進行表達,但是病毒載體有諸多危險性如:局部炎癥反應,感染的風險,目的基因在體內隨機表達等副作用限制了它的在臨床的應用,其他載體如質粒,但其轉染率則非常低，不適合臨床應用。近年來干細胞的研究取得了很大的進展，我們前期研究發(fā)

5、現(xiàn)用干細胞治療能夠解決以上我們面臨的諸多問題，因為干細胞具有多能性而且轉染目的基因后其多向分化能力仍不受影響、體外容易擴增、基因轉導率高、表達目的基因持久等優(yōu)點成為目前基因治療載體的最佳選擇。干細胞可以作為載體進行基因治療,而且干細胞還可能作為種子細胞替換功能受損的組織細胞，繼續(xù)表達目的基因,并且持續(xù)時間長久。目前干細胞己應用于許多疾病的治療如各種血液腫瘤疾病等，但是在治療糖尿病性勃起功能障礙方面還是比較不多見的，目前只有Bivalac

6、qua等[4]將骨髓間充質干細胞（BMSCs）應用于治療老年性ED取得了一定療效，他們發(fā)現(xiàn)將eNOS基因（內皮型一氧化氮合酶）轉入BMSC后可提高療效。但是，骨髓間充質干細胞存在取材不便、培養(yǎng)誘導效率低下，不宜大規(guī)模應該于臨床等問題，限制了它的應用。IPS細胞(Induced pluripotent stem cells，iPS，簡稱誘導多能干細胞)，技術可以克服以上的難題。本課題我們探討應用IPS細胞作為基因治療載體治療DED的可行性

7、，設計使用比BMSCs更具有優(yōu)勢的IPS細胞作為血管內皮生長因子(VEGF)基因的載體來治療DED的研究，希望能夠解決一直困擾著人們的DED治療難題。
　　針對這一問題，我們己經(jīng)進行了相關的前期研究：我們成功地進行了IPS細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和體外誘導分化研究[5，6,7，8]，發(fā)現(xiàn)IPS細胞與BMSCs有相似的生物學特性，同時具有來源充足、取材安全簡便、分離培養(yǎng)容易、體外增殖能力強、基因轉導率高等優(yōu)點，使其更適合于臨床應用；至

8、今為止，小鼠、人、獼猴、大鼠、豬等物種都已建立了iPS細胞系[7,12-15]。而且通過四倍體囊胚嵌合技術，證實了小鼠iPS細胞能發(fā)育成為完整的小鼠個體[16]。目前，iPS技術已迅速向醫(yī)學臨床應用方面展開，特別是在病理模型方面進展顯著，已建立了十多種人類疾病模型的iPS細胞株[17-18]，所以我們探討采用IPS作為種子細胞針對DED的核心發(fā)病機制-血管內皮功能障礙環(huán)節(jié)進行治療。目前我們還完成了慢病毒-VEGF的構建的前期工作。將進一

9、步摸索和確定IPS的感染條件和感染參數(shù)。
　　研究目的：
　　1）建立和完善IPS作為種子細胞的方法。
　　2）建立將VEGF基因高效轉染的載體和IPS的培養(yǎng)建系。
　　3）構建慢病毒-VEGF基因載體，并轉染IPS；將轉染VEGF基因后的IPS細胞進行Elisa，Western blot，RT-qPCR等檢測，以證明能有效分泌VEGF。
　　4）探索IPS聯(lián)合VEGF基因治療DED的可行性及作用機制

10、>　　研究方法：
　　1）SD大鼠iPS細胞的制備。
　　2）iPS細胞的培養(yǎng)建系。
　　3）慢病毒-VEGF載體的構建。
　　4）慢病毒-VEGF轉染IPS。
　　研究結果：
　　1）成功誘導IPS細胞。
　　2）成功構建慢病毒-VEGF基因載體，成功感染IPS并建系。
　　3）通過轉染IPS的種子細胞能有效分泌VEGF(血管內皮生長因子)修復受損的血管內皮細胞。
　　結論：