經(jīng)VEGF-,165-基因修飾后的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞治療糖尿病性勃起功能障礙大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糖尿病(Diabetes mellitus,DM)為代表的代謝性疾病患病率逐年上升，男性糖尿病患者并發(fā)勃起功能障礙的發(fā)病率約三倍于普通人群1-14，并且比普通人群要早10～15年發(fā)病，針對(duì)其發(fā)病機(jī)制及防治的研究十分有必要，因此我們通過(guò)建立DMED大鼠模型研究陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)功能的變化，再構(gòu)建慢病毒-VEGF165載體后轉(zhuǎn)染入脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ADSCs)作為治療DMED的種子細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植入DMED

2、大鼠體內(nèi)觀察其療效。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的建立及陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)的變化。
　　 目的：探討鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立糖尿病勃起功能障礙動(dòng)物模型的可行性，以及測(cè)定陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)功能的變化。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)組SD雄性大鼠分三組(組1、2、3)，分別腹腔注射35mg/kg、40mg/kg、60mg/kg的STZ；正常對(duì)照組。大鼠腹腔注射檸

3、檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。4d后，快速法測(cè)定血糖；10周后，應(yīng)用阿樸嗎啡(APO)100μg/kg皮下注射觀察大鼠陰莖勃起情況并篩選ED模型，并分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)各組及正常對(duì)照組大鼠平均頸動(dòng)脈內(nèi)壓(MAP)、陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)，并收集陰莖組織進(jìn)行免疫組化及Western Blot分析其VEGF系統(tǒng)功能。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中組1糖尿病成模率為87.5％(35/40)，組2和組3成模率均為100％，但組3有17.5％(7/40)的死亡

4、率。實(shí)驗(yàn)組血糖明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，體重、陰莖勃起次數(shù)、陽(yáng)性勃起率及刺激海綿體神經(jīng)后的ICP值則明顯低于正常組(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組間(組1、2、3間)則無(wú)明顯差異；MAP值在各組間無(wú)明顯差異。DMED大鼠陰莖海綿體VEGF系統(tǒng)(VEGF，F(xiàn)lk-1，eNOS)免疫組化及WesternBlot分析均明顯下降。
　　 結(jié)論：腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠最佳注射劑量為40mg/kg，注射STZ后出現(xiàn)典型的糖尿病臨床癥狀，

5、血糖明顯增高，ICP下降，勃起功能明顯受損，APO篩選試驗(yàn)可有效篩選ED模型。DMED大鼠陰莖海綿體VEGF系統(tǒng)功能異常，為后續(xù)研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第二部份：慢病毒-VEGF165載體的構(gòu)建以及其在脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 目的：目前，干細(xì)胞已成為基因治療載體的最佳選擇，但是對(duì)于脂肪干細(xì)胞的相關(guān)研究還很少，因此我們打算構(gòu)建過(guò)表達(dá)VEGF165的慢病毒載體并對(duì)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行感染以期得到用于基因治

6、療的種子細(xì)胞。
　　 方法：通過(guò)PCR方法將EHS1001-68950485313912克隆突變成VEGF165(NM_001025368)轉(zhuǎn)錄本片段。過(guò)表達(dá)慢病毒采用三質(zhì)粒系統(tǒng)(pGC-FU、pHelp1.0和pHelp2.0)進(jìn)行包裝。進(jìn)行滴度測(cè)定后使用構(gòu)建成功的載體對(duì)ADSCs進(jìn)行感染。通過(guò)免疫熒光、western blot和ELISA分析鑒定VEGF165在ADSCs中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：DNA測(cè)序和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2

7、93T細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)證明VEGF165與GFP被成功的構(gòu)建為融合表達(dá)載體。經(jīng)定時(shí)定量PCR檢測(cè)，得到的病毒滴度達(dá)到2×108TU/ml。用過(guò)表達(dá)VEGF165的慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞，western blot、ELISA和免疫熒光檢測(cè)表明基因穩(wěn)定表達(dá)。
　　 結(jié)論：本研究通過(guò)獲得穩(wěn)定表達(dá)VEGF165的脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞為糖尿病性勃起障礙的治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分：經(jīng)VEGF165基因修飾后的脂肪組織來(lái)源的干

8、細(xì)胞治療糖尿病性勃起功能障礙大鼠。
　　 目的：探討經(jīng)VEGF165基因修飾后的ADSCs治療DMED大鼠的有效性。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為五組：A、正常對(duì)照組；B、空白(陰性)對(duì)照組；C、慢病毒-VEGF165治療組；D、空白ADSCs治療組；E、VEGF165-ADSCs治療組。注射后在不同時(shí)間段7天和28天行大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓和平均頸動(dòng)脈壓的測(cè)定，測(cè)壓后取其陰莖組織做免疫組化及Western Blot分析。