基于細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建血管化組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)分化
　　[摘要]目的：體外獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）、純化、擴(kuò)增，同時(shí)探討其生物學(xué)特性及多向分化潛能。方法：全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)MSCs，觀察其增殖、生長(zhǎng)特性和組織學(xué)形態(tài)；并向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化，分別采用鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、油紅O染色和甲苯胺藍(lán)染色鑒定。結(jié)果：貼壁的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為紡錘形，呈克隆樣生長(zhǎng)，性狀穩(wěn)定，

2、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）染色弱陽(yáng)性。經(jīng)成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，表現(xiàn)出相應(yīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征。結(jié)論：全骨髓貼壁篩選法取材方便，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，在不同的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下能夠多向分化。
　　實(shí)驗(yàn)二內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　[摘要]目的：探索分離純化及體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)的方法，并進(jìn)行鑒定。為采用EPCs促進(jìn)

3、血管化組織工程骨的構(gòu)建策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：將骨髓單核細(xì)胞(mononuclearcells,MNCs)接種至明膠涂層的培養(yǎng)皿內(nèi)，使用含10％胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）、添加50μg/mLECGS(endothelialcellgrowthsupplements)的M199培養(yǎng)液，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3天后棄去未貼壁細(xì)胞，此后每3天換液1次。形成內(nèi)皮祖細(xì)胞克隆后，0.05％

4、胰酶-EDTA消化傳代，2-4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)CD31免疫熒光染色、荊豆凝集素免疫細(xì)胞化學(xué)染色、毛細(xì)血管腔形成能力及透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)檢測(cè)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)5-7天，內(nèi)皮祖細(xì)胞的早期克隆形成，中央為大量圓形細(xì)胞。2周后，細(xì)胞表現(xiàn)出典型的“鵝卵石”狀。培養(yǎng)過(guò)程中可形成管腔狀結(jié)構(gòu)。可與荊豆凝集素特異性相結(jié)合；內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD31熒光染色呈陽(yáng)性表達(dá)；透射電鏡觀

5、察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特有的細(xì)胞器-(W-P)小體。結(jié)論：特定的培養(yǎng)條件下可以獲取足量的EPCs，細(xì)胞可迅速體外擴(kuò)增，并具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物。
　　實(shí)驗(yàn)三骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建及成骨分化研究
　　[摘要]目的：探索體外構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的簡(jiǎn)便方法，分析膜片組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并評(píng)估其成骨分化潛能。方法：將兔MSCs高密度接種于直徑10cm培養(yǎng)皿，成骨誘導(dǎo)條件下連續(xù)培養(yǎng)2周形成細(xì)胞膜片。收獲時(shí)，使用細(xì)胞刮沿皿底小心刮起

6、，或用鑷子輕輕提起。通過(guò)組織學(xué)、組織化學(xué)、堿性磷酸酶活性定量檢測(cè)、透射電鏡、掃描電鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)等一系列方法，檢測(cè)細(xì)胞膜片的物理及生物學(xué)特性。.結(jié)果：高密度連續(xù)培養(yǎng)后形成的MSCs膜片，呈半透明薄膜狀，有彈性，其內(nèi)多個(gè)白色結(jié)節(jié)。HE染色證實(shí)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞膜片是一種由多層細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）組成的聚集體。堿性磷酸酶、茜素紅及Vonkossa等

7、組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性；堿性磷酸酶定量分析含量較高；掃描電鏡及透射電鏡檢查均見(jiàn)基質(zhì)中大量的礦化結(jié)節(jié)聚集。結(jié)論：通過(guò)體外簡(jiǎn)單的連續(xù)培養(yǎng)方法和成骨誘導(dǎo)后，可構(gòu)建具有良好成骨能力MSCs膜片。
　　實(shí)驗(yàn)四骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建血管化組織工程骨
　　[摘要]目的：探討利用MSCs膜片復(fù)合EPCs構(gòu)建血管化的無(wú)外支架組織工程骨的可行性,以解決傳統(tǒng)接種方法存在的諸多問(wèn)題。方法：將骨髓細(xì)胞行雙向誘導(dǎo)：骨髓單核細(xì)胞中MSCs連續(xù)

8、培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成成骨性膜片；另一部分骨髓單核細(xì)胞在內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)分化為EPCs。然后將MSCs膜片復(fù)合EPCs，折疊、卷曲成圓柱狀的復(fù)合細(xì)胞聚集體。最后，將復(fù)合體移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。單純MSCs膜片構(gòu)建組織塊作為對(duì)照。術(shù)后4周，8周分別進(jìn)行大體觀察、顯微CT（micro-computedtomography，Micro-CT）、掃描電鏡及組織學(xué)檢查。結(jié)果：MSCs膜片復(fù)合EPCs構(gòu)建物植入體內(nèi)后

9、，形成血管化骨樣組織，外觀色紅、質(zhì)硬。CT、掃描電鏡及組織學(xué)檢查均證實(shí)新骨形成，而且所形成的骨密度和血管密度均高于對(duì)照組。結(jié)論：首次利用MSCs膜片復(fù)合EPCs構(gòu)建較大體積的血管化組織工程骨，無(wú)需外支架。實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPCs的引入不僅能產(chǎn)生功能性血管網(wǎng)，而且能夠促進(jìn)骨形成。
　　實(shí)驗(yàn)五骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建可注射血管化組織工程骨
　　[摘要]目的：探討可注射的血管化組織工程新的構(gòu)建策略。方法：利用MSCs膜片復(fù)合

10、EPCs，形成具有雙重細(xì)胞成分的聚集體。復(fù)合種子細(xì)胞附著于自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體。再注射至無(wú)免疫動(dòng)物背部皮下，術(shù)后4周，8周分別進(jìn)行大體觀察、顯微CT、掃描電鏡及組織學(xué)檢查，觀察其在體內(nèi)發(fā)育成骨樣組織的能力。結(jié)果：MSCs膜片/EPCs復(fù)合體，可以順利通過(guò)注射針頭至皮下。8周后形成鮮紅骨樣組織，呈扁圓形，外周密布一層血管網(wǎng)，質(zhì)地硬，最大長(zhǎng)度近2.0cm。Micro-CT影像顯示高密度礦化組織

11、形成。橫斷面掃描電鏡觀察呈現(xiàn)松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)大量片狀骨小梁排列，交織為多孔的網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)。組織學(xué)檢查證實(shí)新生的骨組織和豐富的血管形成。此外，新骨的形成存在兩種方式：組織塊外周以膜內(nèi)骨化為主，骨基質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)骨細(xì)胞，骨小梁邊緣成行排列矮柱狀的成骨細(xì)胞；組織塊內(nèi)部還可見(jiàn)肥大的軟骨細(xì)胞和鈣化軟骨，提示軟骨內(nèi)骨化方式。結(jié)論：本研究，首次驗(yàn)證了將EPCs復(fù)合MSCs膜片，構(gòu)建可注射的血管化組織工程骨的可行性，無(wú)需外源性載體。為構(gòu)建可注射的血管化組織工

12、程骨提供了全新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)六骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片/內(nèi)皮祖細(xì)胞/珊瑚構(gòu)建大塊管狀骨
　　[摘要]目的：利用細(xì)胞膜片技術(shù)，輔以管狀形態(tài)的內(nèi)支撐體，首次探索移植自體體內(nèi)構(gòu)建大塊的具備特定形態(tài)的組織工程骨。方法：構(gòu)建兔來(lái)源MSCs膜片-EPCs，與珊瑚內(nèi)支撐體卷層樣復(fù)合，形成管樣結(jié)構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)，置灌注式生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)8周，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和組織的形成；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，移植自體背部皮下，利用自體的微環(huán)境和自身分泌的各種生長(zhǎng)因子調(diào)控來(lái)完

13、成骨組織的構(gòu)建。體內(nèi)、外標(biāo)本取材，進(jìn)行大體觀察、顯微CT、掃描電鏡及組織學(xué)檢查，分析新骨形成。結(jié)果：體外，隨著灌注式反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛，細(xì)胞與細(xì)胞產(chǎn)生連接，各層聚集體之間逐漸融合、增厚，質(zhì)地變硬，并與珊瑚材料緊密結(jié)合，呈現(xiàn)出白色的骨樣組織外觀。體內(nèi)培養(yǎng)8周后，構(gòu)建了長(zhǎng)度近5.0cm大塊管狀骨。顯微CT、掃描電鏡及組織學(xué)檢查均證實(shí)，珊瑚表面、材料間隙及深部均有新骨形成。結(jié)論：MSCs膜片-EPCs與珊瑚自體體內(nèi)可構(gòu)