基于細(xì)胞膜片技術(shù)復(fù)合脫細(xì)胞軟骨及富血小板血漿構(gòu)建可注射性組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】
　　頜面部骨組織的缺損通常都由外傷、腫瘤或是先天性疾病造成。骨再生是骨缺損修復(fù)的重要手段和發(fā)展方向。目前臨床多采用自體骨移植或者誘導(dǎo)骨組織再生（guided bone regeneration, GBR）的方法來(lái)修復(fù)頜面部骨組織的缺損。但自體骨移植供體有限，且容易發(fā)生缺血壞死，而 GBR技術(shù)僅局限于少量骨組織的再生，遠(yuǎn)不能滿足臨床治療需求。同時(shí)這兩種治療技術(shù)可能會(huì)引起炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致移植物吸收移植失敗。
　　近年

2、來(lái)干細(xì)胞技術(shù)成為骨再生的研究熱點(diǎn)。從發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells, BMSCs）到成功地在動(dòng)物模型中生成骨組織，研究者們對(duì)BMSCs的研究不斷的取得進(jìn)展。基于此，研究人員又探索開(kāi)發(fā)出新的干細(xì)胞，如脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）,牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells, DPSC），牙周膜干細(xì)胞（periodontal liga

3、ment stem cells, PDLSCs）等等，大大提升了組織再生的效果。而在軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程中，參與的干細(xì)胞聚集并形成軟骨導(dǎo)板，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生細(xì)胞的肥大化、血管化進(jìn)而礦化、骨化。成軟骨細(xì)胞分化的干細(xì)胞分泌成血管因子和相關(guān)趨化因子并募集宿主的細(xì)胞參與軟骨導(dǎo)板的礦化和血管化的骨重建。大量軟骨組織工程研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的成軟骨細(xì)胞聚集成細(xì)胞簇后增強(qiáng)了其軟骨形成的能力。在細(xì)胞之間的相互連接和細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用調(diào)節(jié)下，

4、BMSCs來(lái)源的成軟骨細(xì)胞的重塑能力因?yàn)橥庠葱缘纳L(zhǎng)因子的參與而較單純的支架干細(xì)胞移植加強(qiáng)了。
　　目前已有的研究中為了實(shí)現(xiàn)骨缺損修復(fù)通常都是采用羥基磷灰石、三磷酸三鈣等生物陶瓷來(lái)充當(dāng)骨替代品，但這些人工合成的生物材料在人體內(nèi)降解速率很低，與宿主本身的骨組織的融合情況也不佳，而且很容易引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致移植失敗，而患者也為此要承受多次手術(shù)的創(chuàng)傷。因此開(kāi)發(fā)一種微創(chuàng)的、低免疫排斥的以及可以很好的塑型的骨替代品是目前很值得期待的治療方法。

5、顆?；拿摷?xì)胞軟骨基質(zhì)（particulate decellularized cartilage matrices, PDCM）支架，本身來(lái)源于有機(jī)體，取材豐富，在去除細(xì)胞后保留了原有的細(xì)胞外基質(zhì)及基質(zhì)內(nèi)含有的生長(zhǎng)因子，極其有利于組織的再生。此外去除細(xì)胞后，多孔狀的三維結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的附著，便于后期血管的長(zhǎng)入，為骨再生過(guò)程中的血管化提供了很好的空間結(jié)構(gòu)。其本身因?yàn)楸Ａ袅思?xì)胞外基質(zhì)而使支架具有了一定的機(jī)械強(qiáng)度。
　　作為組

6、織工程三要素之一的生長(zhǎng)因子也是必不可少的。當(dāng)前的研究中應(yīng)用較多的是骨成型蛋白（bone morphology protein, BMP）。該蛋白表現(xiàn)出較好的促成骨和成軟骨能力，但由于提取及提純成本高，大大增加了臨床應(yīng)用的成本。水凝膠雖然保留了一定的化學(xué)和機(jī)械性能，但與干細(xì)胞共同植入體內(nèi)后的效果仍然差強(qiáng)人意，不時(shí)伴有炎癥反應(yīng)，中央壞死等。富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）中富含600多種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因

7、子可以大大促進(jìn)血管生成以及骨重建。而且PRP可以從自體提取，不僅保證了來(lái)源更降低了應(yīng)用的免疫排斥反
　　應(yīng)，因而逐漸成為近年來(lái)骨再生研究中的“明星因子”。
　　因此本實(shí)驗(yàn)提出利用成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞膜片碎化再?gòu)?fù)合PDCM和PRP成為可注射性的凝膠狀混合物通過(guò)軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程實(shí)現(xiàn)骨再生。這項(xiàng)技術(shù)不僅使實(shí)驗(yàn)操作更為簡(jiǎn)便，減少了對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷，更為以后臨床轉(zhuǎn)化為微創(chuàng)操作提供可能，為骨的再生提供一種全新方法。
　　【目的】

8、
　　探討應(yīng)用經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs膜片碎塊（bone marrow stem cells bricks, CB）與PDCM以及PRP復(fù)合通過(guò)軟骨內(nèi)成骨構(gòu)建可注射性組織工程骨的可行性。
　　【方法】
　　1.BMSCs細(xì)胞膜片的培養(yǎng)及鑒定：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔BMSCs成膜片并進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，剪碎。對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞膜片分別進(jìn)行電鏡掃描（scanning electron microscope, SEM），番紅O染色，

9、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)其成軟骨和肥大相關(guān)基因表達(dá)。
　　2.PDCM支架制備及鑒定：剪取新鮮兔耳，粉碎后，1％十二烷基硫酸（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, SDS）化學(xué)方法脫細(xì)胞。對(duì)PDCM分別進(jìn)行掃描電鏡觀察，蘇木精-伊紅染色（Hematoxyl

10、in-eosin staining，HE），番紅O染色，二型膠原免疫組織化學(xué)染色，以及膠原總量（COL, collagen）和糖胺多糖（glycosaminoglycan, GAG）總量的定量檢測(cè)。
　　3.PRP制備：取新鮮兔耳動(dòng)脈血兩次離心制備PRP。
　　4.裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)：將 BMSCs膜片碎塊與制備好的PDCM和PRP混合均勻，注射到裸鼠背部皮下。對(duì)照組裸鼠皮下注射PDCM和PRP混合物。分別在植入4周,12周時(shí)

11、取材，對(duì)樣本進(jìn)行濕重、體積、厚度等大體觀察以及組織學(xué)染色等方法評(píng)價(jià)。
　　5.兔子脛骨頭種植體周圍骨缺損模型修復(fù)：將來(lái)自同只兔子骨髓培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后成膜并剪碎與PDCM和PRP混合注射到新西蘭大白兔脛骨上種植體周圍骨缺損中，以PDCM和PRP混合物為對(duì)照組，12周后取材，進(jìn)行Micro-CT、組織學(xué)等檢測(cè)。
　　6.采用 SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或者是隨機(jī)分組的兩組間均值t的檢驗(yàn)。

12、
　　【結(jié)果】
　　1.BMSCs成乳白色膜片，可用器械夾持，具有一定的厚度，SEM鏡下和番紅O染色結(jié)果顯示 BMSCs膜片有多層細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)相互交聯(lián)，RT-PCR結(jié)果顯示 BMSCs初步肥大化并表達(dá)了相關(guān)基因如 COL-I、COL-X以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等。
　　2.HE和番紅O染色結(jié)果顯示PDCM經(jīng)過(guò)

13、脫細(xì)胞后除去了細(xì)胞只剩余細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)，膠原和糖胺多糖的定量檢測(cè)結(jié)果顯示，PDCM保留了大量的膠原和糖胺多糖,體視顯微鏡和掃描電鏡下PDCM直徑200μm左右，可使其順利通過(guò)16G注射器針頭。
　　3.裸鼠皮下實(shí)驗(yàn)證實(shí)顆?；拿摷?xì)胞軟骨-BMSCs細(xì)胞膜片碎塊-富血小板血漿（ particulate decellularized cartilage matrices-BMSCs bricks-platelet rich

14、plasma, PDCM-CB-P）復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)早期（4周）快速血管化，CD-31熒光染色中可見(jiàn)大量血管樣結(jié)構(gòu)，同時(shí)COL-I和COL-X等軟骨內(nèi)成骨的膠原逐漸增多，天狼星紅染色顯示，新生成的COL-I和COL-X在不斷的增多，并在12周時(shí)HE和馬松三染色都顯示生成了了大量的類骨質(zhì)基質(zhì)和骨組織，而對(duì)照組則在4周時(shí)血管化很差， CD-31熒光染色中幾乎看不到內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記，在12周時(shí)HE和馬松三染色中也未見(jiàn)明顯成骨，且免疫組化染色結(jié)果顯

15、示COL-I和COL-X低表達(dá)。
　　4.兔子脛骨頭種植體周圍骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，注射的PDCM-CB-P復(fù)合物經(jīng)過(guò)體內(nèi)12周的時(shí)間后其中的PDCM比對(duì)照組PDCM-P中的PDCM更快的被骨組織所代替。Micro-CT結(jié)果顯示PDCM-CB-P組比PDCM-P組在種植體周圍生成了更多的骨組織，同樣的苦味酸-酸性品紅染色（vangieson, VG）也顯示PDCM-CB-P組在種植體周圍形成了更多的骨組織并結(jié)合更緊密，而 HE和馬松

16、三染色則可見(jiàn)PDCM-CB-P組種植體周圍有較多松質(zhì)骨生成，幾乎未見(jiàn)PDCM,而PDCM-P組則生成了較少的松質(zhì)骨同時(shí)仍然可見(jiàn)較多的PDCM。
　　【結(jié)論】
　　1.成軟骨誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞膜片、PDCM以及PRP的復(fù)合物可注射并很好地維持了注射后包塊的形貌和體積,具有很好的支撐性。
　　2.PDCM-CB-P復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了早期快速血管化并很好的實(shí)現(xiàn)成骨。
　　3.PDCM-CB-P復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了種植體周圍缺損快