STAT3介導(dǎo)microRNAs調(diào)控的IL-9過表達(dá)在慢性淋巴細(xì)胞性白血病免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的研究.pdf

1、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL，簡稱慢淋)是單克隆性小淋巴細(xì)胞惡性增殖性疾病，其特點(diǎn)為成熟樣的B淋巴細(xì)胞在血液、骨髓、淋巴結(jié)、肝和脾大量蓄積，最后累及淋巴系統(tǒng)以外的組織。慢性淋巴細(xì)胞白血病病因尚未明了，感染、免疫與遺傳等因素備受關(guān)注。CLL細(xì)胞形態(tài)上類似成熟淋巴細(xì)胞，實(shí)質(zhì)上是一種免疫學(xué)上不成熟、功能不完善的細(xì)胞。盡管單克隆抗體應(yīng)用及免疫治療已經(jīng)得到人們的廣泛關(guān)注并取得一定療效，但是C

2、LL仍然是一種除造血干細(xì)胞移植以外不可治愈的疾病。研究證明CLL患者體內(nèi)存在T、B細(xì)胞構(gòu)成比例及功能失調(diào)，免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，因此開展對CLL中異常免疫和免疫調(diào)控的研究有望為CLL發(fā)生發(fā)展機(jī)理的深入探討、腫瘤免疫治療及新藥開發(fā)等提供理論依據(jù)。
　　近年來，白介素9(inter leukin-9，IL-9)在腫瘤免疫中的作用已經(jīng)得到了越來越多的關(guān)注。長期以來，人們認(rèn)為IL-9是Th2類細(xì)胞因子，作用于多種炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞，

3、在對抗寄生蟲感染和誘導(dǎo)變應(yīng)性疾病，尤其是過敏性哮喘中發(fā)揮著重要的作用。最近的數(shù)據(jù)表明，T細(xì)胞分泌的IL-9介導(dǎo)了肥大細(xì)胞的募集，參與腫瘤免疫，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)增殖和抗凋亡活性，這些都表明IL-9在腫瘤進(jìn)展中可能存在潛在作用。IL-9活化后也參與了IL-2，4，7，15參與的信號通路，這些信號通路是通過細(xì)胞因子的特異性受體鏈與STAT家族的γ鏈形成異二聚體所介導(dǎo)的。
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(Signal transduce

4、r andactiva toroftranscription，STAT3)是近年來研究異常活躍的轉(zhuǎn)錄因子，STAT3能夠?qū)⒓?xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞核，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞功能，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程，是細(xì)胞因子受體下游區(qū)重要的信號通路之一。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，STAT3是在多種腫瘤組織與細(xì)胞株中異常表達(dá)，是促進(jìn)炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，STAT3持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了舉

5、足輕重的作用，目前已被公認(rèn)為癌基因。
　　microRNAs（miRNAs）的表達(dá)水平在預(yù)測慢性淋巴細(xì)胞性白血病的臨床預(yù)后方面是很有價值的。在結(jié)構(gòu)上，miRNAs為一類短小的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA片段，長度約為19-25個核苷酸。這些RNA是從初級轉(zhuǎn)錄本，也就是pri-miRNA，轉(zhuǎn)變成為稱為pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最后成為具有功能的miRNA。miRNA來自一些從DNA轉(zhuǎn)錄而來，但無法進(jìn)一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)的RNA（屬于非編碼

6、RNA）。miRNA通過與靶信使核糖核酸(mRNA)特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。近年來的研究表明在CLL中存在幾種染色體異常，如11Q-，13Q-，17β-，和12號染色體三體的分子畸變，還包括miRNA15a和16-1的喪失或下調(diào)以及抗凋亡基因的過度表達(dá)。已有研究顯示在惡性血液病腫瘤患者血液中存在miR-15a/16，miR-29及miR-155簇表達(dá)的缺失或下調(diào)，并且它們的表達(dá)缺失或下調(diào)與IgVH表達(dá)和ZAP-70狀態(tài)呈正相關(guān)

7、。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在白血病患者中的過表達(dá)與各種染色體畸變有相關(guān)性，比如17P，提示miR-21的表達(dá)可能可以預(yù)測患者的生存率。
　　IL-9，STAT3，以及microRNAs均與腫瘤的生長有關(guān)，但I(xiàn)L-9在CLL患者中的表達(dá)及它們之間的交互作用尚不清楚。在本研究中，我們證實(shí)了在CLL患者血清中IL-9的表達(dá)水平明顯升高，IL-9表達(dá)的不同與CLL患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后密切相關(guān)。而pSTAT3及microRNAs的表達(dá)也

8、明顯升高。對MEC-1細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)表明，在CLL細(xì)胞中可能存在一個“胞外IL-9-STAT3-miR-155，miR-21-胞內(nèi)IL-9”的正反饋系統(tǒng)。
　　第一部分:CLL患者及正常對照組外周血中IL-9、STAT3及microRNA的檢測
　　目的:CLL是一組在組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及臨床預(yù)后方面均存在很大的異質(zhì)性的侵襲性惡性腫瘤。CL1的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程，目前雖然做了大量研究，其病因及發(fā)

9、病機(jī)制仍不清楚。本研究檢測了IL-9、STAT3及microRNAs在CLL病人外周血中的表達(dá)，并探討了IL-9的過表達(dá)與CLL患者預(yù)后因子之間的關(guān)系，為患者預(yù)后的評價提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.標(biāo)本收集
　　2.分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononu clearcells，PBMCs)及CD19+B細(xì)胞
　　3.ELISA檢測分析
　　4.提取RNA，進(jìn)行實(shí)時定量RT

10、-PCR
　　5.蛋白提取及蛋白印跡分析
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1.通過47例CLL患者外周血血清樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)CLL患者血清中IL-9的水平增高，血清IL-9的陽性檢測率為52.4％。對20例IL-9血清水平增高的患者我們分別采用逆轉(zhuǎn)錄PCR及Western-blot檢測IL-9的表達(dá)，最終確定，IL-9在患者的外周血單個核細(xì)胞的mRNA和蛋白水平均有表達(dá)。與正常人的CD19+細(xì)胞相比，CLL患

11、者的外周血單個核細(xì)胞中擁有更高的IL-9mRNA水平(P＜0.05)。此外，通過對western-blot蛋白條帶的灰度分析，表明IL-9在CLL患者蛋白水平的表達(dá)也顯著高于正常人(P＜0.0001)。IL-9表達(dá)不同的CLL患者在年齡、性別水平上沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。但是患者血清IL-9的表達(dá)水平與臨床分期（P＜0.05），ZAP-70的表達(dá)水平(P=0.0272)，B2微球蛋白的表達(dá)水平(P=0.0101)，IgVH基因突變狀態(tài)(P

12、=0.0320)具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。CLL患者血清IL-9水平與預(yù)后之間存在相關(guān)性。
　　2.通過對20例血清IL-9增高的CLL患者的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)STAT3均有磷酸化表達(dá)，通過對蛋白條帶的灰度分析表明，pSTAT3蛋白水平明顯高于正常對照，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)。
　　3.我們繼續(xù)對20例患者的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)microRNA155及microRNA

13、21mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.CLL患者IL-9水平明顯增高，升高的IL-9水平與患者的臨床分期，ZAP-70的表達(dá)水平，B2微球蛋白的表達(dá)水平，IgVH基因突變狀態(tài)呈正相關(guān)。
　　2.CLL患者的pSTAT3水平明顯增高。
　　3.CLL患者的microRNA155及microRNA21mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照。
　　第二部分:CLL

14、中IL-9與STAT3信號通路的相關(guān)調(diào)節(jié)作用
　　目的:我們在第一部分的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，在CLL患者的血清中，IL-9的表達(dá)有上調(diào)，而在外周血單個核細(xì)胞的蛋白水平及mRNA水平上，也存在IL-9的表達(dá)，并且IL-9的表達(dá)與患者的不良預(yù)后有相關(guān)性。我們從IL-9過表達(dá)的患者中檢測到pSTAT3水平明顯增高。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們將在CLL細(xì)胞株中，檢測IL-9與STAT3的磷酸化是否具有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，并檢測IL-9對CLL細(xì)胞增殖

15、及凋亡是否有影響，并探索IL-9對細(xì)胞的影響是否是通過STAT3的磷酸化起作用的，而它們之間是否存在正反饋?zhàn)饔谩亩鴮L-9影響CLL細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制進(jìn)行初步的探索，達(dá)到更深入了解IL-9介導(dǎo)的信號通路的目的。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.MEC-1細(xì)胞的預(yù)處理
　　3.蛋白提取及蛋白印跡分析
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
　　5.CCK8法檢測細(xì)胞增殖
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析

16、r>　　結(jié)果:
　　1.我們檢測的CLL細(xì)胞株是MEC-1細(xì)胞株，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細(xì)胞株中，我們進(jìn)行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，STAT3的磷酸化水平逐漸增高，并有時間依賴性，在加入IL-9培養(yǎng)2h的時候，STAT3的磷酸化水平達(dá)峰值。加入抑制劑（STAT3抑制劑:Wp1066）處理后，兩者的磷酸化水平明顯減低。
　　2.我們繼續(xù)用Western-blot法檢測預(yù)處理后的細(xì)胞株IL

17、-9的表達(dá)水平，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細(xì)胞株中，IL-9的表達(dá)也有時間依賴性，在加入IL-9培養(yǎng)2h的時候，IL-9表達(dá)水平達(dá)峰值。加入Wp1066(10nM)處理后，IL-9的表達(dá)明顯減低。
　　3.我們檢測預(yù)處理后細(xì)胞的增殖及凋亡情況。在加入或不加入抑制劑培養(yǎng)48h后，用IL-9終濃度為20ng/ml的IMDM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MEC-1細(xì)胞不同的時間點(diǎn)后，利用CCK8法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，隨著IL-9的培養(yǎng)

18、時間增加，細(xì)胞增殖作用逐漸增加，在培養(yǎng)2h后，細(xì)胞增殖增加約20％，而這種作用能被抑制劑消除，同樣，在細(xì)胞加入IL-9培養(yǎng)2h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞株的凋亡水平發(fā)現(xiàn)，能夠減低細(xì)胞凋亡至基礎(chǔ)水平的40％左右，而抑制劑也可以消除這種作用。
　　結(jié)論:
　　1.MEC-1細(xì)胞株經(jīng)過IL-9預(yù)處理后，STAT3的磷酸化水平逐漸增高，抑制劑可消除這種作用。
　　2.MEC-1細(xì)胞株經(jīng)過IL-9預(yù)處理后，IL-9表達(dá)水平逐漸增高，

19、抑制劑可消除這種作用。
　　3.胞外IL-9可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。
　　4.胞外IL-9的刺激可引起STAT3的磷酸化，進(jìn)而正反饋調(diào)節(jié)胞內(nèi)IL-9的分泌。
　　第三部分CLL中由microRNAs調(diào)控STAT3介導(dǎo)的IL-9過表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制
　　目的:最近的數(shù)據(jù)表明，IL-9參與腫瘤免疫是由T細(xì)胞和肥大細(xì)胞介導(dǎo)的。它在多個轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的促進(jìn)增殖和抗凋亡活性也表明在腫瘤進(jìn)展中可能存在潛在作用。本研究應(yīng)用

20、人慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株MEC-1為研究對象，應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)microRNAs高表達(dá)，進(jìn)一步研究CLL中由microRNAs調(diào)控STAT3介導(dǎo)的IL-9過表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.質(zhì)粒載體介導(dǎo)的上調(diào)慢性淋巴細(xì)胞性白血病的microRNA基因
　　3.上調(diào)microRNA基因細(xì)胞的預(yù)處理
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率
　　5.蛋白提取及蛋白印跡分析<

21、br>　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
　　7.CCK8法檢測細(xì)胞增殖
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)microRNA155和microRNA21高表達(dá)后，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細(xì)胞株中，我們進(jìn)行Westem-blot檢測發(fā)現(xiàn)IL-9在CLL細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，且這種作用可以被STAT3的抑制劑所抑制(Wp1066)。
　　2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)micr

22、oRNA155和microRNA21高表達(dá)后，CLL細(xì)胞增殖增加(n=3，P＜0.0001)，細(xì)胞凋亡受抑（n=3，P＜0.0001）。
　　結(jié)論:
　　1.microRNA155和microRNA21高表達(dá)引起的胞內(nèi)IL-9的分泌可以促進(jìn)CLL細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。
　　2.經(jīng)胞外IL-9的刺激后，上調(diào)microRNA155和microRNA21基因表達(dá)后的細(xì)胞的胞內(nèi)IL-9分泌明顯增加。
　　3.IL-9可