IL-1β介導(dǎo)膿毒癥血管低反應(yīng)性的α1腎上腺素能受體失敏及鈣失敏機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:
　　膿毒癥是臨床最古老又最難避免的疾病之一,盡管新的治療藥物和手段不斷涌現(xiàn),但其死亡率卻始終高居不下。因此進(jìn)一步闡述其病理生理機(jī)制,尋找新的、更特異性的藥物作用靶點(diǎn)顯得尤為重要。
　　膿毒癥血管低反應(yīng)性的發(fā)生是導(dǎo)致難治性低血壓的發(fā)生和高死亡率的重要原因。對于血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為主要與血管舒縮相關(guān)受體失敏;鉀離子通道的激活引起血管平滑肌細(xì)胞膜的超極化,以及本實驗室提出的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)鈣失

2、敏學(xué)說(力/鈣比下降)有關(guān)。
　　作為膿毒癥時機(jī)體產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子,體、內(nèi)外研究均證實 IL-1β參與了膿毒癥血管低反應(yīng)性的發(fā)生,而對于其介導(dǎo)作用機(jī)制,目前認(rèn)為有ΝΟ依賴性作用機(jī)制:誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)活性增高,導(dǎo)致ΝΟ產(chǎn)生增加,引起VSMC舒張;ΝΟ非依賴性作用機(jī)制:血管舒縮相關(guān)受體失敏和鉀離子通道的激活使 VSMC膜超極化。但是針對上述機(jī)制的治療只能部分恢復(fù)血管反應(yīng)性,提示存在著其它作用機(jī)制或具有較目前更特異的作用靶點(diǎn)

3、。
　　鑒于α1腎上腺素能受體(α1 ARs)在心血管系統(tǒng)中的重要作用以及在感染、創(chuàng)傷、休克等應(yīng)激反應(yīng)中的重要地位。IL-1β對膿毒癥VSMCα1ARs失敏(即對其特異激動劑所引起的血管收縮能力下降,受表達(dá)量和親和力影響)作用明確。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-1β對α1 ARs親和力無明顯作用,但能降低血管α1 ARs的表達(dá),但對其調(diào)控機(jī)制卻不甚清楚。
　　α1ARs包含有α1A,α1B,α1DAR三個亞型,它們的分布、表達(dá)量和表達(dá)

4、調(diào)控機(jī)制具有種屬和組織差異性。多種研究提示IL-1β調(diào)節(jié)基因表達(dá)的信號通路主要有:NF-κB, p38 MAPK和JNK通路,另外ERK,JAK-STAT通路也可發(fā)揮作用。鑒于α1ARs的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有種屬和組織差異性,對于不同種屬的調(diào)控信號通路是否一致,目前并不清楚。另外IL-1β對基因的表達(dá)調(diào)控有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平差異,那么IL-1β對α1 ARs的表達(dá)調(diào)控是通過什么水平的呢?目前并未闡明。目前大鼠VSMC的α1ARs各亞型的啟動子

5、區(qū)域均已克隆出來,且主要調(diào)控各亞型啟動子活性的轉(zhuǎn)錄因子也已知道。鑒于IL-1β對α1 ARs各亞型的表達(dá)在同一細(xì)胞(VSMC)中均有相同的下調(diào)作用,我們推測可能通過相同的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,而相同的轉(zhuǎn)錄因子只有Sp1和AP2。假如推測成立的話,那么信號通路與轉(zhuǎn)錄因子間的關(guān)系如何呢?是否有調(diào)控作用呢?也應(yīng)進(jìn)行有益的探索。
　　鈣失敏假說,其發(fā)生機(jī)制與PKC,Rho激酶等的活性下降,激酶抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶(MLCP)活性的能力下降

6、,導(dǎo)致肌肉收縮相關(guān)蛋白20kD?肌球蛋白輕鏈(MLC20)磷酸化水平降低有關(guān)。在同濃度[Ca2+]作用下,引起的收縮力要相對弱些。相對于其它激酶,Rho激酶在其中地位比較突出?；A(chǔ)研究顯示 Rho激酶活性受 RhoA的調(diào)控,RhoA又主要受RhoGEFs調(diào)控,而RhoGEFs的活性又受Gαq/11和Gα12/13的調(diào)節(jié)。VSMCs主要存在的RhoGEF家族成員有:p115RhoGEF,PDZ-RhoGEF,LARG和p63RhoGEF。

7、Gα12/13調(diào)節(jié)p115RhoGEF,PDZ-RhoGEF,LARG的活性,而Gαq/11調(diào)節(jié)p63RhoGEF和LARG的活性。那么究竟IL-1β是否介導(dǎo)膿毒癥血管的鈣失敏發(fā)生呢?如果是的話,它又是通過調(diào)節(jié)哪個或哪幾個 G蛋白的活性進(jìn)而引起相應(yīng)的RhoGEF活性改變來調(diào)控RhoA活性,進(jìn)而調(diào)控Rho激酶活性及MLC20磷酸化水平而導(dǎo)致血管鈣失敏的呢?目前尚不清楚。
　　本研究利用LPS誘導(dǎo)的家兔膿毒癥和盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘

8、導(dǎo)的大鼠膿毒癥模型,以及體外用IL-1β孵育SMAs和VSMCs的方法,運(yùn)用多種生理和分子生物學(xué)技術(shù),觀察 IL-1β對不同種屬(大鼠和家兔)和不同誘導(dǎo)方法所致的膿毒癥動物模型血管低反應(yīng)性的α1ARs和鈣敏感性的介導(dǎo)作用,及其可能調(diào)控機(jī)制,以期更深入闡述膿毒癥血管功能障礙的發(fā)病機(jī)制,為膿毒癥的治療尋找新的特異性靶點(diǎn)。
　　方法:
　　第一部分:明確IL-1β在膿毒癥血管α1腎上腺素能受體失敏和鈣失敏中的作用
　　1.

9、IL-1β對膿毒癥家兔血管鈣和α1腎上腺素能受體敏感性的作用
　　(1)通過LPS靜脈注射復(fù)制家兔膿毒癥模型,檢測不同時相點(diǎn)SMAs的α1ARs敏感性,鈣敏感性,α1ARs表達(dá)水平及血清IL-1β濃度,并分析膿毒癥產(chǎn)生的IL-1β與血管α1ARs敏感性,鈣敏感性和α1ARs表達(dá)水平變化的相關(guān)性。
　　(2)用IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)靜注膿毒癥家兔,觀察其對血管α1ARs和鈣敏感性及α1ARs表達(dá)的影響,在整體動物水

10、平驗證 IL-1β對血管α1ARs和鈣敏感性及α1ARs表達(dá)的作用。
　　(3)體外用不同濃度IL-1β孵育家兔SMAs,檢測SMAs的α1ARs和鈣敏感性及α1ARs表達(dá)水平。在離體動物水平觀察IL-1β對SMAs的α1ARs和鈣敏感性及α1ARs表達(dá)水平的作用。
　　2. IL-1β對膿毒癥大鼠血管鈣和α1腎上腺素能受體敏感性的作用
　　(1)通過盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)方法復(fù)制膿毒癥大鼠模型,檢測不同時相點(diǎn)大鼠SM

11、As的α1ARs敏感性,鈣敏感性,α1ARs表達(dá)水平及血漿 IL-1β濃度,并分析膿毒癥產(chǎn)生的IL-1β與血管α1ARs敏感性,鈣敏感性和α1ARs表達(dá)水平變化的相關(guān)性。
　　(2)采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞。用不同濃度(0,1,10,100 ng/ml)重組IL-1β孵育平滑肌細(xì)胞,在離體水平觀察IL-1β對VSMCα1ARs的表達(dá)和MLC20磷酸化水平的影響(分別代表α1ARs和鈣敏感性)。
　　第二部分

12、:探索IL-1β介導(dǎo)膿毒癥血管鈣失敏的機(jī)制
　　1. IL-1β介導(dǎo)家兔血管鈣失敏機(jī)制的探索
　　1)應(yīng)用PKC、Rho激酶激動劑、拮抗劑處理SMAs,觀察PKC,Rho激酶在IL-1β介導(dǎo)的鈣敏感性改變中的作用。
　　2)觀察IL-1β對SMAs反映鈣敏感性的檢測指標(biāo):MLC20的磷酸化水平的影響
　　3)觀察IL-1β對SMAs PKC、Rho激酶活性的影響。
　　2. IL-1β介導(dǎo)大鼠血管鈣失敏機(jī)制

13、的探索
　　1)檢測IL-1β對VSMCs的Rho激酶活性的影響。
　　2)檢測IL-1β對VSMCs的Gα11、Gαq、Gα12、Gα13表達(dá)水平的影響。
　　3)檢測IL-1β對VSMCs的總RhoGEF及PDZ-RhoGEF和p63-RhoGEF活性的影響。
　　4)聯(lián)合運(yùn)用NF-κB,p38 MAPK, JNK通路特異性抑制劑,觀察NF-κB,p38 MAPK, JNK通路特異性抑制劑對Gα11和Gα12

14、表達(dá)水平的影響。
　　5)觀察IL-1β對VSMCs的AP2α表達(dá)水平的影響;運(yùn)用AP2αsiRNA觀察AP2α對Gα12表達(dá)水平的影響。
　　第三部分:探索IL-1β介導(dǎo)膿毒癥血管α1腎上腺素能受體失敏的機(jī)制
　　1. IL-1β介導(dǎo)家兔血管α1ARs失敏機(jī)制的探索
　　1)IL-1β聯(lián)合JAK2-STAT3通路抑制劑孵育家兔SMAs,觀察JAK2-STAT3通路在IL-1β介導(dǎo)的SMAsα1ARs表達(dá)調(diào)控中的

15、作用,以及對α1ARs敏感性的影響。
　　2)觀察IL-1β對SMAs STAT3的DNA結(jié)合能力的影響。
　　2. IL-1β介導(dǎo)大鼠血管α1ARs失敏機(jī)制的探索
　　1)聯(lián)合運(yùn)用JNK,p38 MAPK, NF-κB通路抑制劑,觀察各通路抑制劑在IL-1β介導(dǎo)的VSMCsα1ARs表達(dá)調(diào)控中的作用
　　2)聯(lián)合運(yùn)用放線菌素D,觀察IL-1β對α1ARs mRNA半衰期的影響。
　　3)克隆α1DAR啟動

16、子,并構(gòu)建雙螢光素酶標(biāo)記質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染VSMCs,觀察IL-1β對α1D AR啟動子活性的影響。
　　4)檢測IL-1β對轉(zhuǎn)錄因子Sp1,Sp3,AP2,NF-κB p50,NF-κB p65表達(dá)水平、DNA結(jié)合能力的影響,以及轉(zhuǎn)錄因子在IL-1β介導(dǎo)的α1ARs表達(dá)調(diào)控中的作用。
　　5)觀察JNK,p38 MAPK, NF-κB信號通路與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用關(guān)系:信號通路對轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和DNA結(jié)合能力的影響
　　結(jié)果:

17、
　　第一部分.IL-1β通過誘導(dǎo)α1腎上腺素能受體失敏和鈣失敏介導(dǎo)膿毒癥血管低反應(yīng)性的發(fā)生
　　(一)IL-1β介導(dǎo)膿毒癥家兔血管α1腎上腺素能受體和鈣失敏的發(fā)生
　　1.膿毒癥家兔SMAs的鈣敏感性,α1ARs敏感性和各亞型α1ARs的表達(dá)呈時間依賴性降低,而家兔血清 IL-1β水平在給 LPS后4h明顯升高。相關(guān)性分析顯示給 LPS后4 h血漿IL-1β水平與血管α1ARs和鈣敏感性及α1ARs表達(dá)水平的變化存在

18、顯著負(fù)相關(guān)。同時IL-1ra能明顯改善血管的鈣和α1ARs敏感性及α1ARs表達(dá)水平。整體實驗提示:IL-1β介導(dǎo)膿毒癥血管鈣失敏和α1ARs失敏。
　　2. IL-1β能明顯降低離體SMAs的鈣和α1ARs敏感性,以及α1ARs表達(dá)水平。離體實驗進(jìn)一步證實:IL-1β能介導(dǎo)血管鈣失敏和α1ARs失敏的發(fā)生。
　　(二)IL-1β介導(dǎo)膿毒癥大鼠血管α1腎上腺素能受體和鈣失敏的發(fā)生
　　1.膿毒癥大鼠SMAs SMAs的

19、鈣和α1ARs敏感性及α1ARs的表達(dá)均明顯降低,而血漿 IL-1β水平卻明顯升高,與同時期 SMAs的鈣和α1ARs敏感性及各亞型α1ARs的蛋白水平呈明顯負(fù)相關(guān)。整體實驗提示:IL-1β可能介導(dǎo)膿毒癥血管鈣失敏和α1ARs失敏。
　　2. IL-1β能明顯降低血管平滑肌細(xì)胞的MLC20磷酸化水平和各亞型α1ARs的蛋白水平,這兩指標(biāo)間接反應(yīng)鈣和α1ARs敏感性。離體實驗證實:IL-1β能介導(dǎo)血管鈣失敏和α1ARs失敏的發(fā)生。<

20、br>　　第二部分.IL-1β調(diào)節(jié)膿毒癥血管鈣失敏的可能機(jī)制
　　(一)IL-1β介導(dǎo)家兔膿毒癥血管鈣失敏的可能機(jī)制
　　1. PKC、Rho激酶激動劑能明顯改善IL-1β孵育血管的鈣敏感性,Rho激酶特異抑制劑能明顯進(jìn)一步降低IL-1β孵育血管的鈣敏感性,但PKC的特異抑制劑卻不能明顯改變其鈣敏感性。提示:PKC、Rho激酶都可能參與IL-1β介導(dǎo)的血管鈣失敏作用。
　　2. IL-1β能明顯降低離體SMAs的MLC

21、20磷酸化水平。提示:IL-1β是通過下調(diào)MLC20磷酸化水平介導(dǎo)血管鈣失敏的。
　　3. IL-1β能明顯降低離體SMAs的PKC、Rho激酶活性。提示:IL-1β能通過下調(diào)PKC、Rho激酶活性介導(dǎo)血管鈣失敏的。
　　(二)IL-1β介導(dǎo)大鼠膿毒癥血管鈣失敏的可能機(jī)制
　　1.IL-1β能明顯降低大鼠VSMCs的Rho激酶活性。提示:Rho激酶在IL-1β介導(dǎo)大鼠膿毒癥血管鈣失敏機(jī)制中的作用。
　　2.IL-

22、1β能明顯提高VSMCs的Gα11表達(dá)水平,但卻明顯降低Gα12表達(dá)水平,而對Gαq和Gα13表達(dá)水平無明顯改變。提示:IL-1β對介導(dǎo)鈣敏感性調(diào)節(jié)的G蛋白存在差異表達(dá)調(diào)節(jié)。
　　3.IL-1β能明顯提高VSMCs的p63 RhoGEF活性,卻明顯降低VSMCs的總RhoGEF和PDZ-RhoGEF活性。提示:RhoGEF活性與其上游G蛋白的表達(dá)變化方向一致,得出G蛋白表達(dá)水平與活性變化方向一致;由于總RhoGEF活性下降,得出G

23、α12介導(dǎo)的RhoGEF活性變化作用可能強(qiáng)于Gα11介導(dǎo)的RhoGEF活性變化作用。
　　4.運(yùn)用NF-κB,p38 MAPK和JNK抑制劑,得出NF-κB抑制劑組能明顯降低IL-1β調(diào)節(jié)的VSMCs的Gα11表達(dá)水平,但p38 MAPK或JNK抑制劑不能明顯改變Gα11表達(dá)水平,NF-κB或p38 MAPK或JNK抑制劑均不能明顯改變Gα12表達(dá)水平。提示:IL-1β調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要信號通路中,只NF-κB對Gα11表達(dá)有正向

24、調(diào)節(jié)作用。
　　5.IL-1β明顯降低VSMCs的轉(zhuǎn)錄因子AP2α表達(dá)水平。RNA干擾結(jié)果顯示AP2α對 Gα12表達(dá)有正向調(diào)節(jié)作用。結(jié)果提示:IL-1β能通過下調(diào) AP2α表達(dá)水平介導(dǎo)VSMCGα12表達(dá)下調(diào)。
　　第三部分IL-1β介導(dǎo)膿毒癥血管α1腎上腺素能受體失敏的可能機(jī)制
　　(一)IL-1β介導(dǎo)膿毒癥家兔血管α1腎上腺素能受體失敏的可能機(jī)制
　　1.通過運(yùn)用JAK2-STAT3通路抑制劑(AG490)

25、,發(fā)現(xiàn)其能明顯升高IL-1β處理SMAs的α1ARs表達(dá)水平以及α1ARs敏感性。提示JAK2-STAT3通路可能參與了IL-1β調(diào)節(jié)α1ARs的表達(dá)。
　　2.IL-1β能明顯升高STAT3的DNA結(jié)合能力,AG490和未生物素標(biāo)記的STAT3共有序列探針(競爭性探針)均能明顯降低STAT3的DNA結(jié)合能力。提示:IL-1β調(diào)節(jié)血管α1ARs的表達(dá)可能通過轉(zhuǎn)錄因子STAT3發(fā)揮作用。
　　(二)IL-1β介導(dǎo)膿毒癥大鼠血管

26、α1腎上腺素能受體的可能機(jī)制
　　1. NF-κB通路抑制劑能明顯增加IL-1β處理的大鼠VSMCs各亞型α1ARs的表達(dá),但JNK或p38 MAPK通路抑制劑卻不能明顯改變各亞型α1ARs的表達(dá)。提示:NF-κB通路在IL-1β調(diào)節(jié)VSMCsα1ARs表達(dá)中的重要作用。
　　2. IL-1β對大鼠VSMCs各亞型α1ARs的mRNA半衰期無明顯作用。但I(xiàn)L-1β明顯降低大鼠VSMCsα1D AR啟動子活性。提示:IL-1β

27、不是通過轉(zhuǎn)錄后影響大鼠VSMCsα1ARs mRNA穩(wěn)定性而是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)α1ARs表達(dá)的。
　　3. IL-1β能明顯降低Sp1和AP2的表達(dá)水平以及DNA結(jié)合能力,運(yùn)用RNA干擾技術(shù),結(jié)果顯示Sp1和AP2都對大鼠VSMC各亞型α1ARs的表達(dá)水平呈正向調(diào)節(jié)。但對Sp3蛋白表達(dá)水平無明顯改變。提示:IL-1β可能通過下調(diào)Sp1和AP2的表達(dá)水平介導(dǎo)大鼠VSMC各亞型α1ARs的表達(dá)下調(diào);Sp1的活性不受Sp3調(diào)節(jié)。
　

28、　4. IL-1β能明顯升高NF-κB p50和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平,且IL-1β能明顯升高NF-κB的DNA結(jié)合能力,RNA干擾實驗結(jié)果提示NF-κB對大鼠VSMC各亞型α1ARs的表達(dá)水平呈負(fù)向調(diào)節(jié)。結(jié)果進(jìn)一步證實NF-κB通路在IL-1β介導(dǎo)VSMCsα1ARs表達(dá)中的重要作用。
　　5. JNK,p38 MAPK,NF-κB通路與Sp1和AP2的關(guān)系:1)各通路抑制劑對IL-1β處理的VSMCs Sp1和AP2的

29、表達(dá)無明顯作用;2)NF-κBp65 siRNA能明顯增加IL-1β處理的VSMCs Sp1和AP2的DNA結(jié)合能力;3)免疫沉淀結(jié)果顯示:IL-1β能明顯增強(qiáng)NF-κB p50與NF-κB p65,Sp1或AP2的結(jié)合能力,但NF-κB p65與Sp1或AP2間,以及Sp1與AP2之間相互作用關(guān)系結(jié)果均為陰性。結(jié)果提示:NF-κB通路不是通過改變Sp1和AP2的表達(dá)而是降低Sp1和AP2的DNA結(jié)合能力來參與IL-1β介導(dǎo)的VSMCs

30、α1ARs表達(dá)的。
　　結(jié)論:
　　1. IL-1β可通過下調(diào)血管的α1腎上腺素能受體敏感性和鈣敏感性介導(dǎo)膿毒癥血管低反應(yīng)性的發(fā)生。
　　2.IL-1β可通過下調(diào)PKC、Rho激酶的活性及MLC20的磷酸化水平介導(dǎo)膿毒癥血管鈣敏感性降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-1β一方面通過下調(diào)AP2α水平使Gα12表達(dá)下降,下調(diào)PDZ-RhoGEF活性;另一方面通過NF-κB途徑上調(diào)Gα11表達(dá),上調(diào)p63 RhoGEF活性,兩方面途徑

31、的總效用是使總RhoGEF活性下降,進(jìn)而使Rho激酶活性以及MLC20磷酸化水平下降而介導(dǎo)膿毒癥血管鈣失敏的發(fā)生。
　　3.IL-1β可通過激活JAK2-STAT3信號通路,提高STAT3與α1ARs啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合能力,下調(diào)α1ARs的表達(dá)介導(dǎo)膿毒癥血管α1ARs失敏。
　　4. IL-1β可一方面通過激活NF-κB信號通路,增加NF-κB與轉(zhuǎn)錄因子Sp1和AP2的相互作用,另一方面下調(diào)Sp1和AP2的表達(dá)水平,兩方