刺芒柄花素應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌治療的初步探討.pdf

1、背景:2005年,美國(guó)M.D.Anderson癌癥中心做了一項(xiàng)大樣本的回顧分析,發(fā)現(xiàn)食用富含植物雌激素的食物可以顯著減少患肺癌的風(fēng)險(xiǎn),尤其是男性和不吸煙者。但是由于存在回憶偏倚以及回顧性研究的缺陷,這項(xiàng)調(diào)查并不完善。2010年,日本公共健康中心對(duì)36177名男性和40484女性長(zhǎng)達(dá)11年的前瞻性研究發(fā)現(xiàn),男性不吸煙者,飲食中植物雌激素含量與患肺癌風(fēng)險(xiǎn)呈高度負(fù)相關(guān),女性不吸煙者則為弱負(fù)相關(guān)。2011年,日本JPHC研究組對(duì)24,127名女

2、性的前瞻性研究發(fā)現(xiàn),血漿染料木素濃度與女性肺癌發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。以上研究提示了植物雌激素與肺癌之間的密切關(guān)系,因此研究植物雌激素對(duì)肺癌的治療作用是一個(gè)重要方向。而紅車軸草異黃酮是一種抗癌效果較好的植物雌激素混合物,主要包括刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、染料木素、大豆素,目前在北美和歐洲作為保健品已經(jīng)上市。但是要將其開(kāi)發(fā)為治療肺癌的藥品,必須闡明其單體對(duì)肺癌的作用機(jī)制,而紅車軸草異黃酮所含單體的分離提純異常困難,因此,刺芒柄花素的分離提純是研究

3、其對(duì)非小細(xì)胞肺癌作用的基礎(chǔ)。
　　目的:通過(guò)對(duì)紅車軸草中植物雌激素的提取分離與純化方法的研究尋找大量提取純化植物雌激素單體的方法;通過(guò)刺芒柄花素血清藥理學(xué)研究,為藥物劑型選擇提供理論基礎(chǔ);將刺芒柄花素及刺芒柄花素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于A549肺腺癌細(xì)胞株,觀察刺芒柄花素對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞株的抑制作用及其與順鉑聯(lián)用的抑制效果。
　　方法:2.5g紅車軸草異黃酮粗提取粉溶于甲醇置于蒸發(fā)皿,加入6g聚酰胺粉(100目～200目)研磨拌

4、樣后干燥,備用。稱取50g聚酰胺粉加入雙蒸水,攪拌至無(wú)氣泡,貼壁裝入層析柱。分別用雙蒸水、無(wú)水乙醇淋洗至流出液經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)無(wú)雜質(zhì)。干法上樣后,分別以雙蒸水-10％乙醇-20%乙醇-30%乙醇-40%乙醇-45%乙醇-50%乙醇做為流動(dòng)相,洗脫液流速為1ml/分鐘,洗脫得樣品溶液每30ml換瓶。將高效液相分析含量>80%的鷹嘴豆芽素A和刺芒柄花素溶液分別混合,水浴蒸干,備用。選用12周齡清潔級(jí)SD成年大鼠24只,雌雄各12只,體重

5、在200-250g之間,隨機(jī)分為6組,禁食12小時(shí)。用灌胃針將配好的刺芒柄花素混懸液(刺芒柄花素480mg、無(wú)水乙醇6ml、1,2丙二醇6ml、吐溫-806ml、蒸餾水42ml)按照1ml/100g灌胃。將6組大鼠分別在灌胃后的第1h,2h,3h,4h,5h,6h使用乙醚麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,每只大鼠采血量約為5ml。所取6組共24管血液以3000r/min的速度離心15min,取血清。每份血清加其2倍體積的醋酸乙酯,置溫水浴超聲震蕩1

6、5min萃取,分液漏斗靜置分離,每份血清萃取3次。3次萃取所得的醋酸乙酯溶液混合,揮干后每份加原血清1/5體積的甲醇溶解,高效液相色譜分析。將A549人肺腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基,接種于100ml培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。對(duì)數(shù)期細(xì)胞胰酶消化后鋪96孔板,24h貼壁后,將刺芒柄花素培養(yǎng)液、順鉑培養(yǎng)液、刺芒柄花素順鉑混合培養(yǎng)液及對(duì)照組共四組培養(yǎng)液加入孔內(nèi),每組10孔,另設(shè)校正孔。24h后換培養(yǎng)液,48

7、h后用MTT比色法檢測(cè)吸光度。設(shè)對(duì)照組抑制率為0,分別計(jì)算各組抑制率。
　　結(jié)果:最終提純88.7%的鷹嘴豆芽素A0.05g,76%的鷹嘴豆芽素A0.12g,71.52%的刺芒柄花素0.04g;將刺芒柄花素灌飼后,所采血清中有刺芒柄花素波峰出現(xiàn),波峰隨時(shí)間有少許上升,說(shuō)明刺芒柄花素可以直接吸收入血。刺芒柄花素波峰與染料木素波峰高度差異不大,但灌胃液中刺芒柄花素含量遠(yuǎn)高于染料木素含量,提示刺芒柄花素的生物利用度可能比較低。刺芒柄花素