組蛋白乙酰化在鼻息肉發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、第一部分:組蛋白乙?；?去乙酰化酶活性在鼻息肉中的變化
　　目的:評估組蛋白乙?；福╤istone acetyltransferases HATs）和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetyltransferases HDACs)活性在鼻息肉組織中的變化，并檢測HDACs基因在鼻息肉組織中的表達變化。
　　方法:收集2012年6月-2012年11月期間復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院鼻息肉和正常鼻黏膜組織標本，提取新鮮

2、組織的核蛋白，分別利用HATs和HDACs活性檢測試劑盒檢測組織核蛋白HATs和HDACs活性，同時通過免疫組化的方法比較組蛋白乙?；潭仍诒窍⑷夂驼１丘つぶ械牟町?另外，提取鼻息肉和正常鼻黏膜組織總RNA，利用熒光定量PCR方法檢測HDACs基因在鼻息肉和正常鼻黏膜組織表達變化。
　　結(jié)果:收集新鮮鼻息肉標本20例，正常鼻黏膜標本6例;成功提取新鮮組織的核蛋白。HATs和HDACs活性檢測結(jié)果顯示在正常鼻黏膜中，HAT/HDA

3、C為1.19±0.33，鼻息肉組織中HAT/HDAC為1.95+0.57(P＜0.01)，提示鼻息肉中存在HAT/HDAC失平衡。HDACs活性檢測顯示鼻息肉中HDACs活性為0.16±0.07/80ug，明顯低于正常鼻黏膜組織HDACs活性（0.35±0.08/80ug）(P＜0.01)，HATs活性未見顯著差異;免疫組化結(jié)果顯示鼻黏膜和鼻息肉組織中黏膜上皮層乙酰化染色陽性，特別是鼻息肉上皮層乙?；黠@增強。實時熒光定量PCR結(jié)果提示

4、HDACs基因在鼻息肉組織中表達與正常對照組之間無明顯差異(P＞0.05)，提示鼻息肉組織中HDACs活性降低與HDACs基因表達無直接相關(guān)性。
　　結(jié)論:鼻息肉組織中HDACs活性降低導致蛋白乙?；鰪?，HDACs活性降低與HDAC基因的表達無直接相關(guān)性，鼻息肉組織中HAT/HDAC平衡向乙酰化增強的方向偏移，提示HAT/HDAC活性改變可能參與了鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展。
　　第二部分:病原微生物對鼻黏膜上皮細胞乙?；癏DA

5、Cs基因表達的影響
　　目的:研究外界病原微生物對鼻黏膜上皮細胞乙?；癏DACs基因表達的影響。
　　方法:取正常鼻黏膜，利用0.01％蛋白酶XIV消化法分離上皮細胞進行體外培養(yǎng)，分別利用細菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS)和聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸Poly(I∶C)刺激鼻黏膜上皮細胞，利用CCK-8檢測不同濃度的刺激因素對鼻黏膜上皮細胞活性的影響。刺激上皮細胞24h后分別收集細胞上清和細胞總RNA，利

6、用酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ELISA）測定鼻黏膜上皮細胞分泌白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)的水平反映刺激因素對上皮細胞的激活作用;通過細胞免疫熒光的方法研究LPS和Poly(I∶C)的刺激對鼻黏膜上皮細胞乙?；挠绊?提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實時熒光定量PCR檢測LPS和poly(I∶C)刺激對鼻黏膜上皮細胞HDACs基因表達的影響

7、。
　　結(jié)果:利用0.01％蛋白酶XIV消化分離的方法能夠成功分離培養(yǎng)鼻黏膜上皮細胞，倒置顯微鏡下觀察見貼壁生長的鼻黏膜上皮細胞呈鋪路石樣形態(tài);細胞培養(yǎng)約7d后可進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)2-3代的上皮細胞依然保持上皮細胞的形態(tài)和增殖特性;細胞活性實驗顯示LPS≥15ug/ml和Poly(I∶C)≥25ug/ml會影響鼻黏膜上皮細胞的活性。LPS(10ug/ml)和Poly(I∶C)(20ug/ml)刺激鼻黏膜上皮細胞24h后可激活上

8、皮細胞，表現(xiàn)為上皮細胞分泌IL-6和IL-8水平顯著升高;細胞免疫熒光結(jié)果顯示LPS和Poly(I∶C)刺激均可引起鼻黏膜上皮細胞乙?；碳に鸬牡鞍滓阴；粌H局限在細胞核，細胞漿內(nèi)亦出現(xiàn)蛋白乙?；?熒光定量PCR結(jié)果顯示LPS和Poly(I∶C)刺激并未引起HDACs基因表達變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:LPS(10ug/ml)和Poly(I∶C)(20ug/ml)刺激24h可導致鼻黏膜上皮細胞蛋白乙酰化增強，引起細胞核

9、蛋白和細胞漿蛋白乙酰化增強。但LPS和Poly(I∶C)刺激并未引起HDACs基因表達的變化。
　　第三部分:抑制HDACs活性對鼻黏膜上皮細胞分泌IL-6、IL-8和LL37的影響
　　目的:探討抑制HDACs活性對鼻黏膜上皮細胞表達IL-6、IL-8和抗菌肽LL37的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)鼻黏膜上皮細胞，同時培養(yǎng)下呼吸道上皮細胞系NCI-H292細胞作為平行對照;利用HDACs抑制劑TSA或SB抑制上皮細胞HD

10、ACs活性，然后利用Poly(I∶C)刺激鼻黏膜上皮細胞，實驗分六組:TSA單獨刺激組;SB單獨刺激組;Poly(I∶C)單獨刺激組;TSA+ Poly(I∶C)聯(lián)合刺激組;SB+ Poly(I∶C)聯(lián)合刺激組;上皮細胞單獨培養(yǎng)組。刺激24h后收集細胞上清、提取細胞總RNA和細胞總蛋白，利用ELISA檢測HDACs抑制劑對不同組鼻黏膜上皮細胞表達IL-6和IL-8水平的影響;利用熒光定量PCR方法檢測不同刺激因素對上皮細胞表達抗菌肽LL

11、37的影響;通過western-blot方法分析抑制HDACs活性對LL37蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:熒光定量PCR的結(jié)果顯示TSA(200nM)和SB(4mM)能夠誘導LL37基因的表達，并且這種促進作用是不依賴于Poly(I∶C)的刺激; western-blot的結(jié)果顯示TSA和SB可誘導NCI-H292細胞LL37蛋白表達增加，而對鼻黏膜上皮細胞、LL37蛋白的表達無明顯影響;ELISA檢測顯示TSA或SB作用于上皮細胞