四川省6種主要馬鈴薯病毒的發(fā)生及其多重RT-PCR檢測(cè)體系的建立.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，它屬于一年生茄科茄屬作物，具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和使用價(jià)值。馬鈴薯極易感染病毒，已經(jīng)報(bào)道的可以侵染馬鈴薯的病毒超過35種，對(duì)四川省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)危害最嚴(yán)重的有6種病毒，主要是馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯M病毒(PVM)。研究表明，這6種馬鈴薯病毒不僅可以單一侵染植株，還常常伴有復(fù)合侵染，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和產(chǎn)量。

2、r>　　四川省自2006年至今沒有再次對(duì)四川省馬鈴薯6種主要病毒的分布進(jìn)行普查，為了解這6種病毒在四川省的分布，本試驗(yàn)應(yīng)用血清學(xué)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)對(duì)采自四川省不同海拔地區(qū)500m以下、500-1000m以及1000m以上的16個(gè)縣（市）的1003份田間馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，6種主要馬鈴薯病毒在四川省均有不同程度的發(fā)病，PVA的發(fā)病率為10.87％，PVM的發(fā)病率為5.68％，PLRV的發(fā)病率為5.

3、38％，PVY的發(fā)病率為19.44％，PVS的發(fā)病率為26.44％，PVX的發(fā)病率為18.74％。2006年，四川省對(duì)馬鈴薯病毒的分布情況進(jìn)行了一次調(diào)查，結(jié)果顯示PVA、PVM、PLRV、PVY、PVS和PVX的發(fā)病率分別為16，41％、9.58％、3.58％、7.14％、61.77％和17.74％，與2015年調(diào)查結(jié)果相比較可看出，PVS病毒的發(fā)病率降低近35％，PVA的發(fā)病率下降5％左右，PVY的發(fā)病率增加近12％，其余三種病毒的發(fā)

4、病率變化不大，總體來(lái)說，除了PVY以外，其余5種病毒的發(fā)病情況得到一定程度的控制，這與近些年馬鈴薯脫毒種薯的種植有很大的關(guān)系。
　　不同海拔高度的發(fā)病情況也不相同，整體來(lái)說海拔在500m以下和500-1000m發(fā)病率較高，1000m以上發(fā)病率相對(duì)較低;每種病毒在不同海拔的發(fā)病情況存在差異，PVA和PVY在海拔500m以下地區(qū)的發(fā)病率較高， PLRV、PVM和PVS在海拔500-1000m地區(qū)發(fā)病率較高，PVX在海拔1000m以上地

5、區(qū)發(fā)病率較高;PVM和PLRV病毒在不同海拔地區(qū)和不同季節(jié)發(fā)病率最低，說明不同海拔對(duì)馬鈴薯6種主要病毒的發(fā)病情況有一定的影響，但季節(jié)對(duì)其影響不大。
　　2014-2015年，對(duì)四川省25個(gè)公司的4793份脫毒種薯樣品進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，PVS的檢出率最高，達(dá)到5.3％，其次是PVM和PVY，檢出率分別為2.09％和2.04％，PVA、PVX和PLRV的檢出率在1％以下;四川省脫毒種薯的生產(chǎn)主要采用基礎(chǔ)苗、原原

6、種、原種和生產(chǎn)種四代種薯繁育體系，檢測(cè)的樣品中基礎(chǔ)苗的合格率為96.75％，原原種合格率為99.53％，原種合格率為83.74％，生產(chǎn)種合格率52.24％，雖然基礎(chǔ)苗、原原種的合格率都相對(duì)較高，但并未達(dá)到純度100％的要求，因此，要從源頭上提高脫毒種薯種苗質(zhì)量，生產(chǎn)中要做到及時(shí)防控，降低病毒的發(fā)生。
　　目前，DAS-ELISA是檢測(cè)馬鈴薯病毒的主要方法，但因其存在成本高、靈敏度不足等缺點(diǎn)，近幾年，分子生物學(xué)的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到馬

7、鈴薯病毒的檢測(cè)中。本試驗(yàn)研究并建立適合同時(shí)檢測(cè)PVA、PVM、PLRV、PVY、PVS和PVX6種主要馬鈴薯病毒的多重RT-PCR檢測(cè)體系，根據(jù)GenBank中公布的6種病毒(CP)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)反應(yīng)過程中的Taq酶濃度、dNTPs濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在25ul的體系中Taq酶的終濃度為0.03U/ul、dNTPs的終濃度為0.16mmol/L，反應(yīng)程序中退火溫度為54℃，循環(huán)次數(shù)為35