新型Eg5蛋白抑制劑S(MeO)TLC治療膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 膀胱癌主要指膀胱移行上皮細(xì)胞癌,又稱膀胱尿路上皮癌。其中約75％是局限于膀胱粘膜層(Ta)和粘膜下層(T1)的非肌層浸潤(rùn)癌:盡管可以通過經(jīng)尿道膀胱鏡切除并配合術(shù)后腔內(nèi)化療灌注治療,約2/3的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā),并且復(fù)發(fā)患者中15％～30％會(huì)進(jìn)展為更高的病理分期和/或伴有分級(jí)升高。除了腫瘤分期和細(xì)胞分級(jí),雖然以往的研究已經(jīng)報(bào)道了大量的腫瘤分子標(biāo)記物可用以預(yù)測(cè)膀胱癌的預(yù)后,但是目前尚未發(fā)現(xiàn)一種可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　

2、　 肌層浸潤(rùn)性膀胱癌占初發(fā)膀胱癌的25％,預(yù)后較差,5年生存率僅為10％～50％。對(duì)伴有轉(zhuǎn)移的晚期浸潤(rùn)性膀胱癌的傳統(tǒng)化療方法是甲氨蝶呤、長(zhǎng)春堿、多柔比星和順鉑聯(lián)合用藥的MVAC方案。該聯(lián)合化療方案雖然可以取得46％～60％治療反應(yīng)率,但也伴有嚴(yán)重的毒性反應(yīng),而且患者經(jīng)過數(shù)療程治療后可能出現(xiàn)獲得性耐藥。近年來,盡管毒性較低的吉西他濱和順鉑新型GC聯(lián)合方案開始逐漸成為一線的晚期膀胱癌化療措施,然而該方案治療反應(yīng)率并不比傳統(tǒng)的MVAC高。因

3、此,尋找新的治療晚期膀胱癌的化療方法已經(jīng)成為近期研究的熱點(diǎn),以求在減低化療毒性的基礎(chǔ)上提高療效,為患者延長(zhǎng)生存時(shí)間并爭(zhēng)取更好的生活質(zhì)量。
　　 紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5在細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,近年來成為了靶向抗癌治療的研究熱點(diǎn)。Eg5在增殖組織細(xì)胞中表達(dá),其主要功能與雙極紡錘體的形成和分離有關(guān),在細(xì)胞有絲分裂早期中起到了關(guān)鍵作用。
　　 研究已經(jīng)證實(shí)Eg5蛋白在惡性組織中存在高表達(dá),但是在有絲分裂后分化穩(wěn)定的成熟組

4、織細(xì)胞中不表達(dá),如中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。研究結(jié)果證實(shí)Eg5作為新的特異性抗有絲分裂藥物的靶點(diǎn)進(jìn)行抗癌治療時(shí),不會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成直接損害而出現(xiàn)類似于抗微管藥物的神經(jīng)病變副作用。研究也表明Eg5與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),而且最近的臨床研究還提示Eg5在惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平與化療療效以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。
　　 1999年研究發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Eg5蛋白小分子抑制劑monastrol,monastrol能特異地與驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5結(jié)合并抑制

5、Eg5功能,從而使細(xì)胞有絲分裂停滯,具有強(qiáng)烈抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞分裂增殖的作用。Monastrol不抑制其他的驅(qū)動(dòng)蛋白活性功能,從而具有較少的副作用和廣泛的抗腫瘤作用。以上的特點(diǎn)均促使近年來大量研究集中在研制Eg5抑制劑作為新的抗有絲分裂化療藥物應(yīng)用上,并取得了很多令人興奮的結(jié)果,臨床試驗(yàn)也已經(jīng)用來檢驗(yàn)Eg5抑制劑的抗癌效果。
　　 2004年Dimitrios A等首先證實(shí)了STLC是作用于Eg5靶點(diǎn)的強(qiáng)有力的小分子抑制劑,與mo

6、nastrol具有相同的Eg5結(jié)合位點(diǎn),且結(jié)合牢固、特異性高,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力提高了36倍。日本京都大學(xué)對(duì)STLC的衍生物進(jìn)行研究后首先報(bào)道了S(MeO)TLC是一種強(qiáng)有力的小分子細(xì)胞滲透性Eg5抑制劑,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力比STLC提高了10倍,而且S(MeO)TLC與STLC一樣具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外,京都大學(xué)藥學(xué)部最近又研制了多種聯(lián)芳類Eg5抑制劑。
　　 如上所述,Eg5與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),已經(jīng)有多種Eg5小

7、分子抑制劑成為靶向抗癌藥物的研究熱點(diǎn),但是目前還沒有Eg5蛋白表達(dá)與膀胱癌生物學(xué)行為以及臨床預(yù)后的相關(guān)性研究,也沒有Eg5蛋白抑制劑治療膀胱癌的系統(tǒng)研究。所以,在本次研究中,研究者通過山東海外留學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)項(xiàng)目,在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院和日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)部對(duì)Eg5蛋白表達(dá)與膀胱癌關(guān)系以及5種Eg5抑制劑(STLC、S(MeO)TLC、KPYC10665、KPYC1066和KPYC10728)治療膀胱癌的療效進(jìn)行了研究。從而為膀胱腫瘤的臨床診

8、斷、預(yù)后判斷以及化學(xué)治療提供有效地新型方法。
　　 目的：
　　 本研究首先探討Eg5蛋白表達(dá)水平與與膀胱癌生物學(xué)行為以及非肌層浸潤(rùn)癌患者術(shù)后預(yù)后間關(guān)系的探討:并進(jìn)一步研究新型的Eg5蛋白抑制劑對(duì)膀胱癌的治療效果,尤其是針對(duì)晚期轉(zhuǎn)移癌的療效。
　　 方法
　　 (1)采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)了193例膀胱癌臨床標(biāo)本中的Eg5表達(dá)(分級(jí):1級(jí)32例,2級(jí)98例,3級(jí)63例:分期:Ta期49例,T1期1

9、14例,T2～T4期30例),分析Eg5表達(dá)水平與腫瘤生物學(xué)行為指標(biāo)之間的關(guān)系,并通過生存分析研究了Eg5表達(dá)水平與163例非肌層浸潤(rùn)膀胱癌患者經(jīng)膀胱鏡電切治療后的預(yù)后間關(guān)系。
　　 (2)培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞并通過免疫印跡方法檢測(cè)各種細(xì)胞株中Eg5蛋白表達(dá)水平,包括RT112、KU7、RT4、EJ細(xì)胞等:同時(shí)通過免疫印跡方法檢測(cè)正常膀胱粘膜、高分級(jí)和低分級(jí)膀胱癌組織標(biāo)本中Eg5表達(dá)水平。
　　 (3)體外實(shí)驗(yàn):采用MTT及臺(tái)

10、盼蘭染色細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)對(duì)比S(MeO)TLC及其他4種Eg5抑制劑(KPYC10665、KPYC10666、KPYC10728和STLC)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制能力,并進(jìn)一步通過Heochst細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果和機(jī)制。采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Caspase凋亡通路蛋白,探討S(MeO)TLC誘導(dǎo)膀胱癌凋亡的分子通路機(jī)制。
　　 (4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用KU7細(xì)胞株建立裸鼠膀胱癌模型,包括皮

11、下腫瘤模型與全身多發(fā)轉(zhuǎn)移癌模型,研究藥物的體內(nèi)抗癌療效；通過經(jīng)腹腔注射Eg5抑制劑,觀察藥物抑制膀胱癌皮下腫瘤生長(zhǎng)情況,并通過活體體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)檢測(cè)S(MeO)TLC治療晚期轉(zhuǎn)移癌的療效。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Eg5的表達(dá)與腫瘤床分級(jí)(P=0.002)和分期(P=0.021)顯著相關(guān)。163例非肌層浸潤(rùn)膀胱癌患者術(shù)后平均隨訪32.52m(6～72m),Kaplan-Meier單因素變量分析表明Eg5強(qiáng)表達(dá)

12、患者無復(fù)發(fā)生存期顯著降低(P=0.012),而對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)臨床進(jìn)展時(shí)間的影響未達(dá)顯著水平(P=0.070)。但是針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)的T1期膀胱癌患者,單因素變量分析表明Eg5強(qiáng)表達(dá)復(fù)發(fā)患者無腫瘤進(jìn)展生存期呈顯著降低(P=0.041)。隨后的Cox風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析顯示膀胱癌細(xì)胞分級(jí)(P=0.045)以及Eg5表達(dá)水平(P=0.029)是預(yù)測(cè)非肌層浸潤(rùn)癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 (2)蛋白免疫印跡檢測(cè)各種膀胱癌細(xì)胞株均表達(dá)E

13、g5,且浸潤(rùn)性來源細(xì)胞株表達(dá)較強(qiáng);正常膀胱粘膜不表達(dá)Eg5蛋白,高分級(jí)腫瘤表達(dá)高于低分級(jí)腫瘤。(P<0.05)
　　 (3)體外實(shí)驗(yàn)表明S(MeO)TLC在5種被檢測(cè)的Eg5抑制劑具有最強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用,導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂停滯形成單極紡錘體細(xì)胞,進(jìn)而同時(shí)激活內(nèi)源性和外源性Caspase依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 (4)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明S(Meo)TLC能有效地抑制皮下腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.05),20mg/k

14、g S(Meo)TLC治療組腫瘤可出現(xiàn)明顯壞死。S(MeO)TLC能有效抑制晚期膀胱癌轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng):與對(duì)照組小鼠相比,治療組小鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)膀胱癌Eg5強(qiáng)表達(dá)患者腫瘤分化較差且高表達(dá)T1期患者可能具有較早的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn),Eg5表達(dá)水平是預(yù)測(cè)非肌層浸潤(rùn)膀胱癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 (2)S(McO)TLC作為新型的Eg5蛋白靶向抑制劑,能顯著抑制體內(nèi)

15、膀胱腫瘤生長(zhǎng),尤其是對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的晚期膀胱癌具有很好的治療效果。創(chuàng)新及意義
　　 (1)國(guó)內(nèi)外首次研究TEg5蛋白表達(dá)水平與膀胱癌生物學(xué)行為和非肌層浸潤(rùn)膀胱癌術(shù)后預(yù)后之間關(guān)系。為膀胱癌臨床診斷以及預(yù)后判斷提供依據(jù)。
　　 (2)國(guó)內(nèi)外首次證實(shí)了Eg5蛋白可以作為膀胱癌治療的有效靶點(diǎn)；并首次對(duì)S(MeO)TLC治療惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)療效進(jìn)行了研究；首次研究了Eg5抑制劑治療膀胱癌的抗癌療效,尤其是晚期轉(zhuǎn)移癌的治療作用?？蔀榘?/p>