新型NF-κB抑制劑Clitocine抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、化療是癌癥臨床治療的重要手段，化療藥物通過(guò)直接殺死腫瘤細(xì)胞或者抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化來(lái)達(dá)到治療效果?；煹娜毕菔菬o(wú)差別地對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性也是目前癌癥治療的一個(gè)主要障礙，近90％的轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)癌癥病人治療失敗都是由于耐藥性引起的。因此尋找高效低毒的抗腫瘤藥物以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性(Drug Resistance)是治療癌癥的兩個(gè)重要課題。本研究從蘑菇中提取到一種天然藥物成分Clitoc

2、ine(克力托辛)，并發(fā)現(xiàn)該化合物能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。更為重要的是我們首次報(bào)道了Clitocine能有效誘導(dǎo)耐藥性腫瘤細(xì)胞的凋亡以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。本文從分子生物學(xué)水平揭示了Clitocine的抗腫瘤生物活性的分子機(jī)理，并首次確定了該化合物是NF-κB的抑制劑，這一發(fā)現(xiàn)暗示了Clitocine可能具備更加廣泛的生物活性。本文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、Clitocine能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡采用MTT法檢測(cè)

3、Clitocine對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示該化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞HepG2、R-HepG2(耐藥性HepG2)和SMMC-7721、宮頸癌細(xì)胞HeLa、胃癌細(xì)胞SGC-7901、子宮癌細(xì)胞MES-SA和MES-SA/Dx5(耐藥性MES-SA)以及乳腺癌細(xì)胞MCF-7和Bcap37等都表現(xiàn)出較高的活性抑制作用，其中對(duì)肝癌的毒性最大。而且Clitocine對(duì)敏感性HepG2細(xì)胞和耐藥性R-HepG2細(xì)胞的毒性很相近。進(jìn)一步實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)果顯示Clitocine能夠誘導(dǎo)耐藥性肝癌細(xì)胞凋亡，包括出現(xiàn)DNA片段化(DNA ladder)、磷脂酰絲氨酸(PS)外翻、Caspase激活、線粒體膜崩潰以及PARP的剪切等一系列凋亡的典型特征。此外，Clitocine誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡涉及細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)兩條信號(hào)通路。
　　 2、Clitocine誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通過(guò)Bcl-2家族成員受到調(diào)控蛋白免疫印跡(Western Blot)結(jié)果顯示，Clitocine能夠使Bcl-

5、2家族成員抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)而促凋亡蛋白Bad上調(diào)。利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)表明Bad的上調(diào)是Clitocine誘導(dǎo)耐藥性肝癌細(xì)胞凋亡的重要原因。
　　 3、Clitocine能夠下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)以逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤細(xì)胞的耐藥性本文選用的兩株耐藥性細(xì)胞株R-HepG2和MES-SA/Dx5都是細(xì)胞膜泵P-糖蛋白(P-glycoprotein)過(guò)表達(dá)的，該蛋白的過(guò)表達(dá)是很多腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要原因；我們的數(shù)據(jù)顯示C

6、litocine能夠顯著降低P-糖蛋白的表達(dá)水平。將Clitocine與阿霉素(Doxorubicin)配伍使用可有效增強(qiáng)耐藥性細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，大幅提高低濃度下阿霉素對(duì)耐藥性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示，Clitocine能夠增加阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累。因此，我們推測(cè)Clitocine能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性與P-糖蛋白的表達(dá)被抑制密切相關(guān)。
　　 4、Clitocine通過(guò)下調(diào)NF-κB抑制P-糖蛋白的表達(dá)熒光

7、定量PCR的數(shù)據(jù)顯示，Clitocine下調(diào)了P-糖蛋白編碼基因MDR1的mRNA水平。我們推測(cè)Clitocine是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MDR1基因的表達(dá)。因此，我們克隆了P-糖蛋白編碼基因MDR1的啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建螢光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)。利用將啟動(dòng)子分段分析的方法，確認(rèn)Clitocine調(diào)控MDR1基因表達(dá)的特定啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件分析，得到NF-κB可能是Clitocine的作用靶點(diǎn)。染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)技術(shù)確認(rèn)了NF

8、-κB能夠直接結(jié)合到我們確認(rèn)的啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域，結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變以及NF-κB的過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)Clitocine的調(diào)控作用。
　　 5、Clitocine能夠抑制NF-κB的激活Clitocine能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)的增加，并降低NF-κB重要下游基因凋亡抑制蛋白家族成員XIAP的表達(dá)。利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)，我們發(fā)現(xiàn)Clitocine能夠有效抑制NF-κB的激活以及活化NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　

9、　 6、Clitocine能夠在動(dòng)物模型中抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)將耐藥性腫瘤細(xì)胞R-HepG2接種到裸鼠皮下形成腫瘤，Clitocine能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外利用剝離的腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Clitocine能夠在體內(nèi)抑制P-糖蛋白的以及NF-κB的表達(dá)。
　　 概括起來(lái)，Clitocine能夠有效誘導(dǎo)耐藥性腫瘤細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)抑制NF-κB的來(lái)下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。我們