Tfh和Breg細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用及MSC對其調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及全身多器官、多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于育齡期婦女，我國的發(fā)病率遠高于國外。SLE發(fā)病機制復雜，目前未完全闡明，但明確的是免疫系統(tǒng)的失調(diào)和紊亂參與了SLE的發(fā)病及后續(xù)的多系統(tǒng)累及。因此，深入揭示SLE發(fā)病的免疫學機制，對尋找新的治療靶點和治療方法，進一步提高SLE的臨床治療水平具有重要的意義。
　　濾泡輔助T細胞(Tfh)是一群近年來發(fā)現(xiàn)的Th細胞，主要分泌IL-21，

2、傳統(tǒng)認為其功能以輔助效應性B細胞分化、成熟及分泌抗體為主，在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，研究表明狼瘡中Tfh細胞比例增加，但Tfh細胞的增加與狼瘡病情活動的關系目前無相關報道。調(diào)節(jié)性B細胞(Breg)是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細胞，在膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)、炎癥性腸病(IBD)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)等動物模型中具有重要的免疫抑制作用。但Breg細胞在SLE中作用，目前研究結(jié)果不盡相同。狼瘡體內(nèi)Breg細胞

3、的比例如何，與病情活動度有無相關性，且Tfh細胞是否對Breg細胞具有輔助作用，其可能的輔助機制如何，目前國內(nèi)外尚無明確報道。
　　此外，間充質(zhì)干細胞(MSC)近年來作為狼瘡治療的新方法，在動物實驗和臨床中取得了初步的療效，其作用機制主要通過分泌抑制性的細胞因子或細胞接觸抑制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但MSC是否能通過調(diào)節(jié)Tfh和Breg細胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用目前無明確結(jié)論，有待進一步的研究。
　　研究目的：
　　第一部分:明

4、確SLE患者外周血中Tfh和Breg細胞比例的變化，分析Tfh和Breg細胞間的相關性，及與SLE病情活動的相關性;
　　第二部分:探討MRL/Ipr狼瘡鼠中Tfh和Breg細胞比例變化和狼瘡病情活動的相關性;
　　第三部分:明確Tfh細胞及其分泌的IL-21對Breg細胞分化的調(diào)控作用和機制;
　　第四部分:明確MSC輸注對MRL/Ipr狼瘡鼠的治療作用，及對Tfh和Breg細胞的調(diào)節(jié)作用。
　　研究內(nèi)容與方法

5、：
　　第一部分
　　熒光顯微鏡下檢測SLE患者外周血中是否存在Tfh和Breg細胞;免疫組化檢測SLE皮損組織中IL-10陽性B細胞的浸潤情況;流式細胞儀檢測30例SLE患者和15例正常對照外周血中Tfh和Breg細胞的比例，并分析兩者的相關性;實時定量RT-PCR(real-time RT-PCR)檢測Tfh和Breg細胞相關細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達;酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測SLE患者血清中IL-21、

6、IL-10、ds-DNA和ANA的濃度;結(jié)合臨床SLEDAI評分分析SLE中Tfh和Breg兩群細胞間的相關性及與SLE病情活動的關系。
　　第二部分
　　流式細胞儀檢測MRL/Ipr狼瘡鼠脾細胞中Tfh和Breg細胞的比例;real-timeRT-PCR檢測Tfh和Breg細胞相關細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達;ELISA檢測外周血清中ds-DNA、ANA、IL-21、IL-10的濃度;免疫組化檢測脾臟生發(fā)中心(GC)的

7、變化，及IL-21和IL-10在脾臟中的表達;分析Tfh和Breg兩群細胞間的相關性及與狼瘡病情活動的關系。
　　第三部分
　　從小鼠脾細胞中分選Tfh細胞，體外培養(yǎng)后收集上清備用;分選小鼠脾臟Na(i)ve B細胞，體外培養(yǎng)時加入上一步收集的Tfh細胞培養(yǎng)上清，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后流式細胞儀檢測Breg細胞的比例，ELISA檢測上清中IL-10的濃度;IL-21體外直接作用于小鼠Na(i)ve B細胞，研究IL-21對Bre

8、g細胞分化和IL-10分泌的影響;同時研究IL-21對Breg細胞分化過程中STAT3活化的影響，并通過阻斷JAK和p-STAT3的活化，明確JAK-STAT3信號通路在IL-21介導的Breg細胞分化過程中的作用;并進一步研究IL-21誘導的Breg細胞的免疫抑制作用。
　　第四部分
　　體外全骨髓貼壁法分離B6鼠來源的MSC，經(jīng)體外培養(yǎng)及純化細胞至第四代(P4)，流式細胞儀檢測其表面的8種標志。MSC與脾細胞共培養(yǎng)后流式

9、細胞儀檢測MSC對Tfh和Breg細胞分化的影響，MSC與體外分選的CD4+T細胞及CD19+B細胞共培養(yǎng)，檢測MSC的對T、B淋巴細胞中細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。分離純化的MSC經(jīng)尾靜脈注射入MRL/Ipr狼瘡鼠體內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后檢測狼瘡鼠的病情變化，流式細胞儀檢測MSC輸注治療后MRL/Ipr狼瘡鼠脾細胞中Tfh和Breg細胞比例的變化。
　　研究結(jié)果
　　第一部分
　　1、SLE患者外周血中存在循環(huán)的Tfh和B

10、reg細胞，兩群細胞比例增多并呈正相關，SLE皮損中IL-10陽性的B細胞增加;
　　2、SLE患者外周血中Tfh分泌的IL-21和Breg分泌的IL-10的基因表達和蛋白分泌都增加，IL-21不僅與自身抗體分泌相關，且與IL-10濃度的增加呈正相關。
　　第二部分
　　1、MRL/Ipr狼瘡鼠脾臟增生明顯，脾細胞中Tfh和Breg細胞的比例擴增，相關細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達增加;
　　2、脾臟中Tfh細胞

11、不與生發(fā)中心形成、自身抗體分泌及狼瘡發(fā)病相關，與Breg細胞的擴增也密切相關僅。
　　第三部分
　　1、Tfh細胞分泌的IL-21能促進Breg細胞的體外分化和IL-10的分泌;IL-21能以時間和劑量依賴的方式促進Breg細胞分化和IL-10的分泌;
　　2、IL-21通過誘導STAT3的磷酸化進而促進Breg細胞的分化和IL-10的分泌，阻斷JAK-STAT3信號通路能抑制IL-21介導的Breg細胞分泌IL-10

12、;
　　3、IL-21誘導的Breg細胞具有明確的免疫抑制作用。
　　第四部分
　　1、小鼠骨髓來源的MSC分離純化到第四代時能獲得較高純度的MSC;
　　2、MSC在體外能抑制Tfh和Breg細胞的分化;
　　3、MSC治療MRL/Ipr狼瘡鼠后，能有效改善狼瘡鼠的病情進展，抑制體內(nèi)Tfh和Breg細胞的分化。
　　研究結(jié)論
　　1、SLE患者外周血中存在擴增的Tfh和Breg細胞，兩群細胞比

13、例增加并與SLE病情活動相關，Tfh細胞的多克隆與Breg細胞的擴增呈正相關;
　　2、MRL/Ipr狼瘡鼠中Tfh和Breg細胞比例增加，Tfh與Breg細胞的擴增呈正相關;
　　3、Tfh細胞可通過分泌的IL-21誘導Breg細胞的分化和IL-10的分泌，IL-21可通過活化STAT3來促進Breg細胞的分化;
　　4、MSC治療能有效改善狼瘡鼠的病情進展，MSC可通過抑制狼瘡鼠體內(nèi)的Tfh細胞發(fā)揮治療作用，MSC