實(shí)驗(yàn)性分子靶向治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，由于其很高的致殘、致死和復(fù)發(fā)率，已成為威脅人類健康的主要疾病之一。該類腫瘤患者即使經(jīng)過手術(shù)、放療和化療等系統(tǒng)治療，預(yù)后仍然較差。其中，最惡性的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)綜合治療后，其總體中位生存期也僅為12-15個月。一旦復(fù)發(fā)，該類患者的總體生存時間也僅為6-8個月。膠質(zhì)瘤具有豐富的血管生成、很高的增殖能力和侵襲性。腫瘤細(xì)胞獲得對抗細(xì)胞調(diào)亡的能力是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，尋找膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生與進(jìn)展中的

2、關(guān)鍵分子，并針對該分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性靶向治療，具有潛在的臨床應(yīng)用價值和廣泛的社會意義。
　　14-3-3蛋白是一類高度保守的小分子多功能酸性二聚體蛋白，存在于幾乎所有真核生物中。在人類，它們有由不同基因編碼的7個亞型，分別命名為β、η、ζ、ε、γ、θ和σ。14-3-3蛋白能通過磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸序列的方式與目標(biāo)分子形成同源或異源二聚體。通過募集配體分子，14-3-3蛋白參與了調(diào)節(jié)多個細(xì)胞過程，包括有絲分裂、凋亡、細(xì)胞周期和侵襲。這

3、些研究提示，14-3-3蛋白可能參與了腫瘤細(xì)胞的多條信號通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在膠質(zhì)細(xì)胞中則無表達(dá)或僅有弱表達(dá)，并與人腦膠質(zhì)瘤的惡性級別及預(yù)后具有密切的相關(guān)性。用14-3-3蛋白特異性的抑制物difopein,抑制14-3-3蛋白與其配體分子之間的相互作用，或通過小干涉RNA下調(diào)14-3-3蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡，提示14-3-3蛋白在細(xì)胞生存中具有重要作用，并為抑制1

4、4-3-3蛋白能夠增加腫瘤的凋亡敏感性提供了依據(jù)。為進(jìn)一步明確這種作用是由一個或多個14-3-3蛋白亞型引起的，我們進(jìn)行了亞型特異性的表達(dá)檢測。對14-3-3蛋白在星形膠質(zhì)瘤的各亞型表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，14-3-3β和η在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈特異性高表達(dá)，并與膠質(zhì)瘤的惡性級別明顯相關(guān)。14-3-3ζ和ε在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常膠質(zhì)細(xì)胞，并與膠質(zhì)瘤的惡性級別明顯相關(guān)。近年的多項(xiàng)研究還提示，14-3-3ze

5、ta在肺癌、乳腺癌等多類腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。目前，國內(nèi)外尚無14-3-3zeta在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的功能研究。基于此，本課題從以下6個方面進(jìn)行了探討。
　　1．14-3-3zeta蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及意義
　　采用免疫組織化學(xué)方法檢測了12例正常腦組織和47例人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本中14-3-3zeta蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，14-3-3zeta蛋白主要表達(dá)于正常腦組織中的神經(jīng)元胞體和突起，而絕大多

6、數(shù)膠質(zhì)細(xì)胞中無14-3-3zeta蛋白的表達(dá)，僅在極少量的膠質(zhì)細(xì)胞中可見弱陽性表達(dá)。14-3-3zeta蛋白主要表達(dá)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的胞漿，呈明顯的強(qiáng)陽性表達(dá)，其表達(dá)率約為74.5％(35/47)。結(jié)合相關(guān)研究，14-3-3zeta蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的強(qiáng)陽性表達(dá)提示其可能在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮了重要作用，這為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2．14-3-3zeta蛋白表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的相關(guān)性研究
　　47例膠質(zhì)母細(xì)

7、胞瘤患者依據(jù)14-3-3zeta蛋白的表達(dá)分為兩組：14-3-3zeta陽性組(n=35)和14-3-3zeta陰性組(n=12)。收集每位患者的臨床病理特征，并展開定期臨床隨訪。通過Kaplan-Meier生存期分析、單因素和多因素回歸分析，用以確定預(yù)后的相關(guān)因子。結(jié)果表明，14-3-3zeta陽性組患者的2年總體中位生存期(12.9月)和生存率(8.6％)明顯低于14-3-3zeta陰性組患者的2年總體中位生存期(17.9月)和生存

8、率(16.7％)(P=0.019)。14-3-3zeta的陽性組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)間隔(5.9月)也短于14-3-3zeta陰性組患者(8.3月)(P=0.002)。單因素和多因素的方差分析提示，14-3-3zeta的陽性表達(dá)是重要的預(yù)后因子。因此，我們認(rèn)為14-3-3zeta可作為判斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的一個潛在指標(biāo)。
　　3.14-3-3zeta蛋白陽性表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)性研究
　　21例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)

9、本分別進(jìn)行14-3-3zeta、Ki67免疫組織化學(xué)染色和TUNNEL染色，分析14-3-3zeta蛋白的表達(dá)(14-3-3zeta免疫組織化學(xué)評分表示)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)用Ki67陽性細(xì)胞數(shù)表示，凋亡指數(shù)(AI)用TUNNEL陽性細(xì)胞數(shù)表示。結(jié)果提示，14-3-3zeta的陽性表達(dá)率為76.2％(16/21)，免疫組織化學(xué)評分為6.29±3.57。增殖指數(shù)Ki67在所有腫瘤樣本均有表達(dá)(5

10、0.08±13.98％)，表達(dá)范圍從27.8％到82.4％。凋亡指數(shù)AI也表達(dá)于所有腫瘤樣本中(3.88±1.41％)，表達(dá)范圍從1.0％到6.4％。14-3-3zeta免疫組織化學(xué)評分與增殖指數(shù)PI呈正相關(guān)(r=0.870,P<0.001),與凋亡指數(shù)AI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.975,P<0.001)。并且14-3-3zeta陽性組腫瘤標(biāo)本的凋亡指數(shù)(3.47±1.19％)明顯低于14-3-3zeta陰性組(5.2±1.13％,t=-2

11、.77,P=0.012)。這些結(jié)果提示14-3-3zeta很有可能參與了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。
　　4．抑制14-3-3zeta蛋白表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體外增殖、凋亡和侵襲的影響
　　以U251和U87細(xì)胞作為研究對象，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將14-3-3zetaRNAi片段和無關(guān)序列轉(zhuǎn)入膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，構(gòu)建14-3-3zetaRNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。RT-PCR和Westernblot證實(shí)，14-3-3zetaRNAi

12、片段足夠下調(diào)14-3-3zeta蛋白的表達(dá)。通過MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流術(shù)細(xì)胞儀(FCM)、細(xì)胞周期測定和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測14-3-3zeta基因表達(dá)下調(diào)后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為改變。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤空白對照組和無關(guān)序列組相比，14-3-3zeta干涉組細(xì)胞的增殖能力明顯下降(P<0.05)，對U251和U87細(xì)胞接種7天后的抑制率分別為57.5±4.2％和53.6±3.4％。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果

13、提示，與空白對照組和無關(guān)序列組相比，下調(diào)14-3-3zeta基因的表達(dá)后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251的克隆形成能力分別降低了1.91和2.03倍，U87細(xì)胞的克隆能力下降了1.89和1.95倍。FCM結(jié)果提示，與空白對照組(0.8±0.1％)和無關(guān)序列組(2.2±0.4％)相比，14-3-3zeta干涉組細(xì)胞中早期凋亡和晚期凋亡均顯著增多(P<0.05)。U251細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率分別達(dá)到了10.4±1.8％和15.1±2.3％。

14、U87細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率分別達(dá)到了11.4±1.6％和12.6±2.8％,與空白對照組(0.5±0.1％)與無關(guān)序列組(1.5±0.4％)細(xì)胞相比，均有顯著提高(P<0.05)。FCM測定細(xì)胞周期顯示，與空白對照組與無關(guān)序列組細(xì)胞相比，14-3-3zeta干涉組細(xì)胞(U251和U87)G0/G1期細(xì)胞顯著增多，G2/M期和S期細(xì)胞明顯減少。Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組(U251：46.3±7.1；U87：57.

15、1±6.9)和無關(guān)序列組(U251：49.2±8.4；U87：62.2±7.8)細(xì)胞相比，14-3-3zeta干涉組細(xì)胞的侵襲能力顯著下降(U251：24.1±3.2；U87：26.3±3.0)。為探索抑制14-3-3zeta基因后腫瘤細(xì)胞生物行為學(xué)改變的可能分子機(jī)制，我們檢測了14-3-3zeta基因敲除后，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果提示，14-3-3zeta基因敲除引起了癌基因Cox2,c-Myc,Surviv

16、in和β-catenin以及侵襲相關(guān)基因E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1未發(fā)生明顯變化，盡管細(xì)胞周期停滯確實(shí)存在。這些結(jié)果提示我們，14-3-3zeta基因敲除后引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的改變可能是一個多基因參與的復(fù)雜過程，更進(jìn)一步的相關(guān)分子機(jī)制仍需闡明。我們的結(jié)果提示，抑制14-3-3zeta的表達(dá)能夠顯著降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。以14-3-3zeta蛋白

17、為靶點(diǎn)是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個潛在手段。
　　5．抑制14-3-3zeta蛋白表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響
　　在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，我們將U87-KD細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染14-3-3zetaRNAi片段)、U87-SCR細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無關(guān)序列)和U87-PAR細(xì)胞(空白對照)分別接種于裸鼠右側(cè)股部建立裸鼠移植瘤模型。每周觀察并記錄腫瘤的生長情況，測定腫瘤最大徑與最小徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。6周后將裸鼠處死，

18、稱腫瘤重量。結(jié)果顯示，與無關(guān)序列組和空白對照組相比，14-3-3zeta干涉組裸鼠形成腫瘤的時間延遲，生長緩慢，腫瘤體積及瘤重均有明顯減少(U87-PAR：1.63±0.37g；U87-SCR：1.58±0.41g；U87-KD：0.73±0.26g；P<0.05)。Ki67免疫組織化學(xué)染色和TUNNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)分別表示腫瘤增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)。結(jié)果顯示，與空白對照組(Ki67：36.2±6.1；TUNNEL：3.7±1.5)和無關(guān)

19、序列組(Ki67：34.5±5.5；TUNNEL：4.5±1.6)相比，14-3-3zeta抑制組的瘤組織凋亡指數(shù)增加，增殖指數(shù)下降(Ki67：18.3±3.1；TUNNEL：24.8±4.9；P<0.05)。上述結(jié)果提示，抑制14-3-3zeta的表達(dá)減緩移植瘤的生長，可能是通過降低瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。
　　6．14-3-3zeta蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及潛在的生物學(xué)意義
　　為了進(jìn)一步明確1

20、4-3-3zeta對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用，我們從12例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中分離培養(yǎng)了5株膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞。首先將腫瘤組織消化成單細(xì)胞，用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)直至形成克隆球，進(jìn)行CD133染色。去除腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液后，換成含10％血清的正常培養(yǎng)基，進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)(GFAP和β-tubulin染色)。同時將1000個膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞種植于裸鼠，在裸鼠皮下形成可見的腫瘤，取瘤組織重新進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)依然能夠形成克隆球。將培養(yǎng)鑒定的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行

21、14-3-3zeta免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果提示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中14-3-3zeta呈陽性表達(dá)。14-3-3zeta蛋白可能在扮演腫瘤起源的腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用，但具體作用仍需進(jìn)行深入研究。
　　綜上所述，本研究首次在國內(nèi)外證實(shí)14-3-3zeta蛋白在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤形成、發(fā)展以及侵襲過程中的發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。在腫瘤干細(xì)胞中其表達(dá)陽性提示14-3-3zeta可能作用于腫瘤干