靶向血管內(nèi)皮生長因子治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤研究.pdf

1、目的：探討靶向血管內(nèi)皮生長因子治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的效果。 材料和方法：用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PcR)方法檢測6例RB標(biāo)本和兩種RB細(xì)胞(SO—RB50和HXO—RB44)中VEGF及其受體VEGFRl／2(Flt／Flk)基因表達(dá)，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以免疫組化方法鑒定RB標(biāo)本中VEGF蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建VEGF小干擾RNA(siRNA)表達(dá)質(zhì)粒p1．0CMV-VEGF siRNA和p4.1CMV-VEGF siRN

2、A，分別瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2種RB細(xì)胞，同時(shí)分別用p1.OCMV-Neg siRNA和p4.1CMV-Neg siRNA作陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染，對(duì)照組質(zhì)粒編碼的siRNA與哺乳動(dòng)物基因組無明顯同源性；空白對(duì)照不作任何處理；用RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后VEGF基因和蛋白表達(dá)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，VEGF基因表達(dá)以熒光半定量PCR(FQ—PCR)方法確定，VEGF蛋白表達(dá)則通過ELISA和蛋白印跡(western blot)方法

3、檢測。將RB細(xì)胞懸液(1×10<'7>細(xì)胞／100u1)裸鼠右前肢背部皮下接種，建立RB移植瘤模型；4周后成瘤鼠被隨機(jī)平均分為3組，組1和組2分別給予0.5mg／ml和lmg／ml的VEGF siRNA溶液處理，組3以PBS處理作為對(duì)照，每2天1次，連續(xù)處理14天；用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；采用FQ—PCR和westernblot方法檢測移植瘤中VEGF表達(dá)水平。最后用Annexin V和caspase-

4、3方法探討沉默VEGF基因表達(dá)后SO—RB50細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：6例RB標(biāo)本和2種RB細(xì)胞中均有VEGF基因及其受體VEGFRl／2表達(dá)，其中VEGFR2基因表達(dá)明顯高于VEGFRl(均p<0.05)，但2種RB細(xì)胞中VEGF基因表達(dá)無顯著差異(p>0.05)，RB標(biāo)本中VEGF蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)。p1.OCMV-VEGF siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，2種RB細(xì)胞中VEGF基因和蛋白表達(dá)均顯著降低(均p<0.05)。p4.1CMV

5、-VEGF siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，2種RB細(xì)胞中VEGF基因下降約80％左右(均p<0.01)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白濃度和對(duì)照組存在顯著差異(均p<0.01)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白也表達(dá)減少。 VEGFsiRNA處理的2種RB移植瘤中VEGF基因表達(dá)降低(均p<0.01)，蛋白水平下降，腫瘤平均體積顯著小于對(duì)照組(均p<0.01)，且高劑量VEGF siRNA組比低劑量組作用更明顯。沉默VEGF表達(dá)后后SO-RB50細(xì)胞凋

6、亡加速(均p<0.05)。 結(jié)論：RB標(biāo)本和RB細(xì)胞均表達(dá)VEGF和VEGFR1/2基因，VEGFR表達(dá)以VEGFR2為主，為VEGF參與RB形成提供了豐富的下游信號(hào)；VEGF siRNA表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，均可作為體外抑制RB細(xì)胞中VEGF表達(dá)的方法，RB研究中可依據(jù)不同需要選用；干擾VEGF表達(dá)，能抑制RB移植瘤生長，降低腫瘤體積；沉默VEGF表達(dá)可促進(jìn)SO-RB50細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞失凋亡可能是VEGF參與RB形