Curcumin治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 膠質(zhì)瘤是一種起源于腦或脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞的原發(fā)性腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是腦膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要分類，占到惡性腦腫瘤的80％以上，是最常見(jiàn)的并最有侵襲性的惡性原發(fā)腩腫瘤（WHOⅣ級(jí)）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是手術(shù)切除并輔以術(shù)后放化療，但是由于腫瘤高度惡性，治療效果差，患者預(yù)后極度惡劣，對(duì)人類健康危害性極大。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)常規(guī)的治療方法不敏感而對(duì)腦組織的治療副作用很大，使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療十分棘手。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

2、的發(fā)病機(jī)制及治療研究是當(dāng)下的一個(gè)熱點(diǎn)。盡管隨著醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)特點(diǎn)也越來(lái)越了解，并發(fā)現(xiàn)了一些新的治療靶點(diǎn)，而且已經(jīng)證實(shí)有許多信號(hào)通路參與到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展及起與耐藥和復(fù)發(fā)相關(guān)，然而人們對(duì)這一復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，很多治療手段還是不盡如人意。對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行分子生物學(xué)研究，探索其發(fā)病及治療規(guī)律，開(kāi)發(fā)新的有效的藥物，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療研究的一個(gè)意義重大的方向。
　　 膳食藥劑例如多酚、

3、黃酮是一類提取于蔬菜水果的化合物的統(tǒng)稱。Curcumin等由于有著較強(qiáng)的抗腫瘤活性，已經(jīng)得到了很深入的研究。它是姜科植物姜黃(Curcuma Longa)的根莖提取物，具有廣泛的藥理作用，能夠抗炎、抗氧化、抗腫瘤。除了能夠預(yù)防腫瘤，Curcumin還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮治療作用。Curcumin抗腫瘤的藥理活性是通過(guò)其調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、炎癥因子、蛋白激酶，以及各種活性蛋白等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。它作用于腫

4、瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)重要信號(hào)通路上，發(fā)揮其抗癌的作用，特別是Curcumin對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有很好的抑制腫瘤活性的作用。利用Curcumin本身防治膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或者以它為參考研發(fā)新藥，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療有重大的意義。
　　 細(xì)胞周期是細(xì)胞存活和增殖的重要事件，受多個(gè)因素嚴(yán)密調(diào)控。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是調(diào)節(jié)細(xì)胞精確分裂的重要機(jī)制，最主要的兩個(gè)檢查點(diǎn)分別G1檢查點(diǎn)和G2檢查點(diǎn)。這些檢查點(diǎn)的作用就是保證細(xì)胞在完成細(xì)胞周期的一個(gè)階段后才能進(jìn)入到

5、下一個(gè)階段。腫瘤細(xì)胞增殖活躍，而抗腫瘤藥物作用的一個(gè)重要機(jī)制就是引起DNA損害，干預(yù)細(xì)胞有絲分裂，使其不能完成細(xì)胞周期某個(gè)階段的準(zhǔn)備，從而停滯在某個(gè)檢查點(diǎn)，或者G1，或者G2。細(xì)胞周期的有關(guān)活動(dòng)受Cyclin和CDK調(diào)控。為調(diào)節(jié)每個(gè)階段正常進(jìn)行，細(xì)胞自身具有調(diào)節(jié)不同周期階段各種變化的激酶的調(diào)節(jié)機(jī)制。許多相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，在有絲分裂和染色體分離過(guò)程中起著重要作用，保證產(chǎn)生正確的子細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞增殖往往與遺傳性的或表觀遺傳性的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白

6、的表達(dá)異?；蛘邔?duì)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的控制失衡引起的，導(dǎo)致了對(duì)細(xì)胞損傷的異常應(yīng)答。這些變化，不僅使細(xì)胞獲得生長(zhǎng)增殖方面的優(yōu)勢(shì)，而且還會(huì)使之易于積累那些可能促發(fā)腫瘤發(fā)生的遺傳變異，從而獲得具有侵襲性的表型。近年來(lái)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的抗腫瘤藥物逐漸引起了人們的重視。一些藥物，本身就是Cyclin或者CDK抑制劑。因此，針對(duì)細(xì)胞周期有關(guān)的抗癌藥物及腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究具有重要意義。
　　 凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，可由多種刺激引起。凋亡在多種

7、生命過(guò)程中起重要作用，例如，正常細(xì)胞循環(huán)、胚胎發(fā)育及個(gè)體發(fā)育，免疫系統(tǒng)行使功能和藥物誘導(dǎo)的死亡等。近二十年來(lái)的研究表明，凋亡是影響甚至決定腫瘤發(fā)生的重要事件。對(duì)凋亡有關(guān)的信號(hào)通路的研究提示了凋亡是如何由腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過(guò)程中對(duì)生理性的應(yīng)激反應(yīng)或者在腫瘤治療過(guò)程中對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)所激發(fā)的。在引起凋亡的應(yīng)激反應(yīng)中，比較重要的是由于促癌基因信號(hào)水平升高以及與DNA損害相關(guān)性增殖信號(hào)增強(qiáng)引起的信號(hào)失衡。凋亡信號(hào)分為上游的調(diào)節(jié)信號(hào)和下游的作用

8、信號(hào)。就其調(diào)節(jié)信號(hào)，分為兩大系統(tǒng)。其一接受處理細(xì)胞間的死亡誘導(dǎo)信號(hào)，另一接受細(xì)胞內(nèi)來(lái)源的信號(hào)刺激。這兩條通路分別激活Caspase-8和Caspase-9，而后，最終激活均行使凋亡功能的Caspase-3，誘導(dǎo)凋亡。對(duì)許多腫瘤包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其發(fā)生往往源于凋亡調(diào)節(jié)通路功能障礙，如NF-κB，STAT3，P13K/Akt以及p53等，導(dǎo)致了機(jī)體不能有效地調(diào)控細(xì)胞凋亡，使受到腫瘤發(fā)生信號(hào)影響的細(xì)胞獲得性狀改變，生長(zhǎng)永生化并獲得侵襲性。所以

9、，進(jìn)一步研究這些通路有關(guān)的腫瘤發(fā)生及凋亡機(jī)制，針對(duì)這些信號(hào)通路進(jìn)行抗癌藥物研究，對(duì)治療腫瘤有極大幫助。
　　 DAPK1(Death Associated Protein Kinase1)是一種鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶。它是一種多功能域蛋白，包括激酶功能域、鈣調(diào)節(jié)功能域、錨蛋白重復(fù)區(qū)、磷酸綁定襻，并有一個(gè)C末端死亡功能域。它的C末端死亡功能域起著蛋白相互作用和形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的作用。DAPK1在多種信號(hào)通路

10、中發(fā)揮作用，可通過(guò)死亡功能域與其它蛋白相互作用，能夠誘導(dǎo)Caspase相關(guān)的凋亡和p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。除了誘導(dǎo)凋亡作用，通過(guò)與Beclin-1作用，它還能提高自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡。DAPK1作為一種腫瘤抑制基因，它的表達(dá)沉默與一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)。不過(guò)，DAPK1在腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)通路中的作用尚未完全清楚，有待于進(jìn)一步的研究。
　　 表觀遺傳是指在有絲分裂和減數(shù)分裂中可遺傳的但不能用DNA序列改變來(lái)解釋的變化。過(guò)去十幾年的研

11、究發(fā)現(xiàn)其中最為主要和重要的是腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。最常見(jiàn)的兩種表觀遺傳現(xiàn)象是DNA甲基化和組蛋白修飾。啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化水平與基因的活躍表達(dá)有關(guān)。約有一半的基因因?yàn)樵趩?dòng)子區(qū)域有CpG島而轉(zhuǎn)錄活躍，而轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的甲基化會(huì)抑制基因表達(dá)。對(duì)腫瘤來(lái)說(shuō)，DNA甲基化是一種保持基因長(zhǎng)期沉默的手段。組蛋白乙?；龠M(jìn)基因表達(dá)，而組蛋白去乙酰化抑制基因表達(dá)。組蛋白甲基化對(duì)基因表達(dá)則可能是激活也可能是抑制。DNA甲基化抑制劑有兩大類，一類是擬核苷劑，

12、一類是非擬核苷劑。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)這類藥物能以較小的劑量取得較大的效果。進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)研究了這些DNMT抑制劑用于治療實(shí)體瘤，如乳腺癌，結(jié)腸癌，腎癌等。還有研究者把DNA甲基化抑制劑和組蛋白去乙?；种苿┙Y(jié)合起來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)谝种颇[瘤的基因表達(dá)和生長(zhǎng)方面有協(xié)同作用。所以，表觀遺傳學(xué)研究會(huì)給腫瘤治療提供新的廣闊空間，對(duì)一些腫瘤抑制基因的表觀遺傳改變的控制將有助于指導(dǎo)針對(duì)相關(guān)腫瘤的新藥研究。
　　 研究目的:
　　 研究膳

13、食藥劑Curcumin引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和周期停滯的分子機(jī)制。
　　 研究腫瘤抑制基因DAPK1在Curcumin抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的作用。
　　 研究Curcumin調(diào)節(jié)基因膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RANK表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　 技術(shù)方法:
　　 1.Curcumin誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡和周期停滯機(jī)制研究
　　 用不同濃度的Curcumin（0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，8

14、0μM）處理U251細(xì)胞24小時(shí)，用CCK-8檢測(cè)Curcumin對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響。
　　 用40μM Curcumin處理U251細(xì)胞24小時(shí)，PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　 用40μM Curcumin處理U251細(xì)胞24小時(shí)，光鏡下檢測(cè)U251細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 以0μM，20μM，40μM Curcumin處理

15、U251細(xì)胞24小時(shí)，Real-time RT-PCR及Western Blotting檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　 2.DAPK1在Curcumin抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制
　　 DAPK1 siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，沉默DAPK1表達(dá)。
　　 Western Blotting檢測(cè)Curcumin對(duì)DAPK1沉默的U251細(xì)胞STAT3和NF-κB磷酸化水平的變化。
　　 EMSA檢測(cè)Cur

16、cumin對(duì)DAPK1沉默的U251細(xì)胞STAT3/DNA和NF-κB/DNA結(jié)合能力的影響。
　　 Western Blotting檢測(cè)Curcumin對(duì)DAPK1沉默的U251細(xì)胞中Caspase-3及期激活片段表達(dá)的影響。
　　 PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Curcumin對(duì)DAPK1沉默的U251細(xì)胞細(xì)胞周期停滯的影響。
　　 Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Curcumin對(duì)DA

17、PK1沉默的U251細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.Curcumin調(diào)節(jié)基因膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RANK表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制用0μM，15μM和30μM的Curcumin處理U251及U87細(xì)胞4日，RT-PCR，Real-time RT-PCR及Western Blotting檢測(cè)RANK的表達(dá)變化。
　　 用30μM的Curcumin或者20μM DAC處理U251及U87細(xì)胞4日，MSP檢測(cè)RANK啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并對(duì)U2

18、51細(xì)胞RANK啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行BSP測(cè)序，檢測(cè)甲基化變化。
　　 M.SssI抑制實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證Curcumin對(duì)DNMT1的抑制作用。
　　 siRNA轉(zhuǎn)染沉默STAT3表達(dá)，對(duì)U251細(xì)胞RANK啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行BSP測(cè)序，檢測(cè)甲基化變化。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)所測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn);多

19、組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，多組間兩兩比較則用LSD檢驗(yàn)，方差不齊選用Dunnett's T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.Curcumin能夠誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡和周期停滯
　　 我們首先采用不同濃度的Curcumin處理U251細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μMCurcumin處理細(xì)胞，對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制率沒(méi)有明顯的作用，而10μM以上的濃度

20、處理24h后，對(duì)細(xì)胞增殖均產(chǎn)生了明顯的抑制效果（F=681.763，P=0.000）。我們發(fā)現(xiàn)Curcumin誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在G2/M期停滯。經(jīng)40μM Curcumin處理24小時(shí)，檢測(cè)周期變化發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照即未處理組相比，U251細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯減少（t=23.091，P=0.000）。Curcumin誘導(dǎo)U251細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期停滯，而不引起G1期停滯。使用FACS檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，使用40μMCurcumin

21、處理U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞24h后檢測(cè)凋亡情況，與未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組對(duì)比結(jié)果顯示，未處理的細(xì)胞凋亡極少;而40μM的Curcumin處理24h后，凋亡細(xì)胞增多(F=42.329，P=0.000)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Curcumin主要通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖，而并不導(dǎo)致其大量壞死。
　　 由于腫瘤細(xì)胞能量的主要來(lái)源是糖酵解，我們首先檢測(cè)了糖酵解有關(guān)的基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)所檢測(cè)的糖酵解通路上的幾個(gè)重要基因，不同劑量Curcumi

22、n處理24 h均未發(fā)現(xiàn)Curcumin對(duì)這些基因mRNA水平的表達(dá)有抑制作用，尤其是腫瘤供能的關(guān)鍵酶PKM2，無(wú)論其mRNA水平還是蛋白水平，Curcumin均未影響其表達(dá)。不過(guò)，HK2的表達(dá)反而有所升高。對(duì)于細(xì)胞周期阻滯，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)40μM的Curcumin處理24h的U251細(xì)胞，Cyclin D1的表達(dá)水平隨并沒(méi)有明顯變化（F=3.534，P=0.097）而Cyclin B1的表達(dá)降低(F=178.522，P=0.000)。說(shuō)

23、明Curcumin誘導(dǎo)的G2/M期停滯是由于Cyclin B1的表達(dá)引起的，而不是通過(guò)Cyclin D1。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Curcumin能抑制Akt磷酸化，較大劑量（40μM）的Curcumin還能抵制Akt的表達(dá)。同時(shí)，Curcumin引起FOXO1的去磷酸化，并且發(fā)生核漿轉(zhuǎn)移，從而得到激活。但是，Curcumin對(duì)FOXO1的表達(dá)產(chǎn)生的影響不明顯。由于磷酸化是這些轉(zhuǎn)錄因子的激活狀態(tài)，這仍然說(shuō)明Akt/FOXO1通路在Curcumin

24、抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡中起著重要作用。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是基因表達(dá)水平還是蛋白水平，Curcumin能抑制cIAP2(BIRC3)，Survivin(BIRC5)的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，Curcumin并不影響其它成員如cIAP1(BIRC2)，Livin(BIRC7)的水平?？梢?jiàn)，BIRC/IAP蛋白家族成員也參與Curcumin對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡的作用。我們同時(shí)還研究了Curcumin對(duì)其配體TRAIL表達(dá)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

25、Curcumin能提高TRAIL的表達(dá)，這說(shuō)明，Curcumin通過(guò)死亡信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，TRAIL也起到一定作用。
　　 2.DAPK1能夠調(diào)節(jié)Curcumin引起的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤調(diào)亡和周期停滯
　　 我們首先觀察到Curcumin處理U251細(xì)胞引起DAPK1 mRNA表達(dá)的升高，并且隨濃度增大而增大（F=165.016，P=0.000）。隨后的WB檢測(cè)證實(shí)了這一點(diǎn)，同時(shí)也證明這一升高也是時(shí)間依賴性的，即同

26、一Curcumin濃度處理不同時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，DAPK1增高越明顯。這些結(jié)果證實(shí)了Curcumin能夠提高U251細(xì)胞中DAPK1的表達(dá)。我們進(jìn)一步研究DAPK1表達(dá)水平的變化是否與STAT3和NF-κB磷酸化水平的改變有關(guān)。因此，我們應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)沉默DAPK1的表達(dá)，兩種所選用的siRNA干擾序列均成功地沉默了DAPK1的表達(dá)。DAPK1表達(dá)沉默并不影響STAT3和NF-κB表達(dá)的改變。另外，Curcumin也不再能夠升高轉(zhuǎn)

27、染si-DAPK1細(xì)胞中DAPK1的水平。其后，我們檢測(cè)了這兩種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平。如圖所示，Curcumin的確抑制了STAT3和NF-κB的磷酸化水平，而DAPK1表達(dá)沉默則減輕了細(xì)胞對(duì)Curcumin所引起的STAT3和NF-KB去磷酸化作用。我們而后研究干擾DAPK1表達(dá)能否調(diào)節(jié)不同Curcumin處理時(shí)間所引起的去磷酸化作用。WB結(jié)果顯示沉默DAPK1表達(dá)可以減緩不同Curcumin處理時(shí)間所引起的去磷酸化。然而，雖然NF-

28、κB的磷酸化水平也被Curcumin極大地抑制了，干擾DAPK1表達(dá)卻沒(méi)能很好地減輕這一抑制作用。沉默DAPK1表達(dá)減輕Curcumin引起的STAT3和NF-κB DNA結(jié)合能力的降低。轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)過(guò)活化后便具有與DNA結(jié)合的能力，一般說(shuō)來(lái)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化表示它的激活狀態(tài)。因此通過(guò)EMSA方法研究了DAPK1表達(dá)沉默對(duì)Curcumin引起的STAT3和NF-κB DNA結(jié)合能力降低的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以40μM Curcumin處理U25

29、1細(xì)胞4h后，STAT3和NF-κB的DNA結(jié)合能力顯著受到抑制。干擾DAPK1表達(dá)盡管沒(méi)能完全恢復(fù)STAT3和NF-κB的DNA結(jié)合能力，但確實(shí)減輕了Curcumin對(duì)它的抑制。因此可以從以上結(jié)果推斷DAPK1能夠促進(jìn)Curcumin對(duì)STAT3和NF-κB DNA結(jié)合能力的抑制作用。我們還檢查了干擾DAPK1表達(dá)對(duì)Curcumin誘導(dǎo)的Caspase-3活化的作用。發(fā)現(xiàn)Curcumin激活了U251細(xì)胞中Caspase-3的活性，表

30、現(xiàn)為WB電泳出現(xiàn)17kDa和19kDa兩條帶。在DAPK1沉默的細(xì)胞中，這兩條帶與si-Ctrl組相比表達(dá)量降低，說(shuō)明Caspase-3激活受到了抑制，表明DAPK1在Curcumin激活Caspase-3過(guò)程中起著正向調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步研究DAPK1在這一過(guò)程中的作用，我們用Curcumin處理轉(zhuǎn)染si-DAPK1的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAPK1表達(dá)沉默的細(xì)胞，其G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯降低而G1期細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P=0.000)，而轉(zhuǎn)染

31、si-Ctrl組的細(xì)胞，DAPK1表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，細(xì)胞的周期分布也沒(méi)有明顯變化。類似地，我們研究發(fā)現(xiàn)沉默DAPK1表達(dá)抑制Curcumin引起的細(xì)胞凋亡（F=637.340，P=0.000）。這些結(jié)果表明，DAPK1參與調(diào)節(jié)Curcumin引起的細(xì)胞周期停滯和凋亡。
　　 3.Curcumin能夠激活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中RANK的表達(dá)。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)，Curcumin提高了U87和U251細(xì)胞中RANK的mR

32、NA表達(dá)水平（P=0.000）。同時(shí)，30μM Curcumin較15μM Curcumin處理引起了更高的表達(dá)水平。Curcumin也提高RANK蛋白水平的表達(dá)。由此我們可以推測(cè)，Curcumin引起的U251細(xì)胞中RANK蛋白水平的升高可能與其mRNA表達(dá)增高有關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明，Curcumin能夠提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中RANK的表達(dá)水平。為鑒定Curcumin引起的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中RANK表達(dá)升高是否是由表觀遺傳修飾的改變引起的

33、，我們首先確定了U251和U87細(xì)胞中RANK啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。在U251和U87細(xì)胞中，RANK啟動(dòng)子區(qū)是高度甲基化的。這一點(diǎn)也被甲基化轉(zhuǎn)移酶DAC處理所證實(shí)。為檢測(cè)前面所觀察到的RNAK表達(dá)升高是否是由于啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的改變引起的，我們檢測(cè)了經(jīng)Curcumin處理細(xì)胞的RANK啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。結(jié)果顯示，它們的甲基化水平發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，即由高甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榈图谆?，在凝膠電泳上表示為甲基化條帶消失。我們進(jìn)一步通過(guò)對(duì)U251細(xì)胞RA

34、NK基因啟動(dòng)子區(qū)域BSP測(cè)序驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)。結(jié)果證實(shí)未經(jīng)Curcumin處理的細(xì)胞表現(xiàn)為高度甲基化，所有檢測(cè)的17個(gè)CpG島均處于甲基化狀態(tài)，而Curcumin處理致使這些CpG島全部非甲基化。這一結(jié)果也正與前面觀察到的甲基化條帶的消失相吻合，進(jìn)一步證實(shí)了Curcumin對(duì)CpG島甲基化狀態(tài)的翻轉(zhuǎn)作用。我們還驗(yàn)證了Curcumin體外抑制DNMT1 analogue M.SssI的作用。結(jié)果顯示，10μM Curcumin已經(jīng)能夠引起M.

35、SssI活性抑制，但10μM和20μM均不能完全抑制它的活性，而40μM Ccurcumin則會(huì)完全抑制M.ssUI的活性。而后，我們研究干擾STAT3表達(dá)是否能促進(jìn)U251細(xì)胞中RANK的表達(dá)。我們以WB來(lái)驗(yàn)證STAT3特異性siRNA轉(zhuǎn)染之后STAT3的抑制情況。我們把STAT3的表達(dá)成功抑制，其磷酸化水平也相應(yīng)降低。在STAT3抑制的細(xì)胞中，RANK的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)升高，提示沉默STAT3表達(dá)足以引起RANK表達(dá)升高。更重要的是，si

36、-STAT3轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞中RANK啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)也發(fā)生了改變，由高甲基化狀態(tài)變?yōu)榈图谆癄顟B(tài)。不過(guò)，在所有檢測(cè)的17個(gè)CpG島中，只有12個(gè)發(fā)生了去甲基化，這一轉(zhuǎn)變水平要低于Curcumin處理的細(xì)胞。不過(guò)，我們的研究結(jié)果仍然說(shuō)明STAT3參與了Curcumin引起的RANK高表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Curcumin能夠抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)發(fā)生G2/M期停滯和凋亡。它對(duì)增殖的抑制作用并不依賴

37、對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié);它誘導(dǎo)G2/M期停滯和凋亡與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和BIRC/IAP蛋白表達(dá)有關(guān)，與調(diào)節(jié)Akt/FOXO1通路和死亡受體信號(hào)通路有關(guān)。
　　 2.Curcumin能夠提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中DAPK1的表達(dá)水平，siRNA轉(zhuǎn)染沉默DAPK1能夠減輕Curcumin誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期停滯和凋亡，也同時(shí)能夠減輕Curcumin對(duì)STAT3和NF-κB的抑制作用以及對(duì)Caspase-3的激活作用。