骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞靶向治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤之一。因腫瘤細(xì)胞早期就有向周圍正常組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)的特性，是膠質(zhì)瘤難以治療及容易復(fù)發(fā)的根源。雖然臨床應(yīng)用手術(shù)、放療、化療等多種治療手段，患者的生存期并沒有得到明顯改善。能夠準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)腫瘤的微衛(wèi)星灶，并將治療藥物靶向作用于腫瘤部位，是治療腫瘤的直接而有效的途徑，也成為目前眾多研究人員所致力解決的課題之一。 近來研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞具有向腫瘤定向遷移的特性。利用干細(xì)胞為載體攜帶治療基因或藥物靶

2、向治療腫瘤可能是腫瘤治療的新突破。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有在不同的誘導(dǎo)條件下向中胚層組織細(xì)胞分化的能力，而且取材方便，體外分離與增殖技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在干細(xì)胞移植和基因治療中頗受青睞。 因此我們首先建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物膠質(zhì)瘤模型用以研究膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)特征，同時(shí)分離大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并應(yīng)用立體定向的方法給膠質(zhì)瘤大鼠接種MSCs細(xì)胞，通過活體動(dòng)物檢測(cè)儀、細(xì)胞的體外增殖分析、免疫組化等方法觀察MSCs細(xì)胞在體內(nèi)及體外的遷移特性及對(duì)腫

3、瘤生長(zhǎng)的影響。 第一部分構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶的9L<'luc>或MSC<'RL>細(xì)胞 首先通過酶切的方法獲得表達(dá)螢火蟲和海腎熒光素酶(F-luc和R-luc)的目的基因片段，將其連接到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pBPLV，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pBPLVPGL<,3>及pBPLV-RL，通過PCR，酶切或DNA序列測(cè)定方法證實(shí)克隆的目的基因序列完全正確后，將慢病毒表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)

4、胞，應(yīng)用無菌流式細(xì)胞分選儀分選出穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶的9 L<'luc>細(xì)胞或海腎熒光素酶的MSC<'RL>細(xì)胞，并擴(kuò)增培養(yǎng)。將9L<'luc>或MSC<'RL>細(xì)胞梯度稀釋于96孔板中，分別加入螢火蟲熒光素酶底物D-luciferin或海腎熒光素酶檢測(cè)試劑，2-5min后放入暗箱中檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9L<'luc>/Msc<'RL>細(xì)胞所釋放的光子量均與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，表明螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入9L或MSC細(xì)胞。

5、 第二部分9L/Wistar腦膠質(zhì)瘤模型的構(gòu)建及9L在Wistar大鼠及F344大鼠生長(zhǎng)特性的對(duì)比觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的9L<'lcu>細(xì)胞，消化、離心，并進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，調(diào)整為終濃度1×10<'5>/μl，并將DAPI與細(xì)胞充分混勻。取成年雄性Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，于前囟中點(diǎn)后1.0 mm，矢狀縫右旁開3.0mm用小型牙科鉆鉆孔。抽取1×10<'6>DAPI標(biāo)記的9L<'luc>膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，經(jīng)顱孔垂直于顱

6、骨外板進(jìn)針5mm，以1μl/min的速度緩慢推注，手術(shù)過程均無菌操作。對(duì)照組動(dòng)物注射等量的PBS。于細(xì)胞移植后0天，7天，14天，21天，分別給予腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-luciferin(150mg/kg)，將動(dòng)物置于活體動(dòng)物檢測(cè)儀密閉的暗箱中成像觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀況。檢測(cè)結(jié)束后，將動(dòng)物脫頸處死，斷頭取腦。以注射部位為中心切取腦組織，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化并做GFAP和Vemintin的免疫組織化學(xué)染色觀察陽性物質(zhì)的分

7、布特點(diǎn)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后7天所有動(dòng)物均可檢測(cè)到腫瘤發(fā)生，7天至21天腫瘤逐漸增大，光子量明顯增強(qiáng)。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)腦立體定位術(shù)后大鼠顱內(nèi)成瘤率100％，低倍鏡下可見腫瘤類似球形，與周圍腦實(shí)質(zhì)邊界較清楚，瘤內(nèi)可見出血，瘤周有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，瘤周及瘤內(nèi)新生血管豐富。高倍鏡下腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，核大，多核，核質(zhì)深染，核異形性高。而免疫組織化學(xué)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞GFAP或Vemintin染色陽性，而腫瘤細(xì)胞問膠質(zhì)網(wǎng)可見陽性染色。結(jié)合H

8、E染色的形態(tài)學(xué)改變，符合低分化的惡性膠質(zhì)瘤的特征，表明9L/Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建成功。 本研究隨之比較9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞在Wistar大鼠及F344大鼠的生長(zhǎng)特性采用立體定向手術(shù)，在Wistar大鼠或F344大鼠右側(cè)尾狀核接種1×10<'5>的9L<'luc>細(xì)胞，分別于接種后7，14，21天通過活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并于檢測(cè)結(jié)束后斷頭取材，觀察腫瘤的形態(tài)學(xué)變化，采用免疫組化的方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞GFAP，

9、Vemintin的表達(dá)，及大鼠腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠或F344大鼠顱內(nèi)接種9L<'luc>細(xì)胞后成瘤率100％，腫瘤組織病理學(xué)均具有惡性膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)；BLI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9L<'luc>/F344膠質(zhì)瘤逐漸增大，而Wistar大鼠在接種同等數(shù)量的9L<'luc>膠質(zhì)瘤細(xì)胞后僅于第7天可檢測(cè)到腫瘤生長(zhǎng)，之后即消失，而且在腫瘤局部可見大量CD<,4>，CD<,8>陽性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；而在9L<'luc>/F344模

10、型中未見CD<,4>、CD<,8>陽性細(xì)胞。 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤的趨化研究 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的9L細(xì)胞培養(yǎng)48h，收上清。在24孔板的中加入無血清的9L上清600μl，將Transwells憩室沒入其中，將體外培養(yǎng)的F344大鼠MSCs消化離心，每個(gè)Transwells板中加入2×10<'5>cells，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。光鏡下觀察結(jié)果，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，觀察MSC細(xì)胞的體外遷移情況。 同時(shí)取對(duì)數(shù)

11、生長(zhǎng)期的9L細(xì)胞，標(biāo)記PKH26染料，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使其終濃度為2×10<'4>/μl，通過立體定向方法于裸鼠的顱內(nèi)接種標(biāo)記PKH26的9L細(xì)胞(1×10<'5>)。接種細(xì)胞后7天，再次通過立體定向方法于膠質(zhì)瘤裸鼠對(duì)側(cè)腦實(shí)質(zhì)接種MSC<'RL>細(xì)胞(1×10<'6>)，接種位置為前囟中點(diǎn)后1.0mm，矢狀縫左旁開3.0mm。對(duì)照組為未接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞，僅接種同等量的MSC<'RL>細(xì)胞。整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在無菌條件下操作。于接種MSC<'RL>后

12、0，7，14天分別于活體動(dòng)物檢測(cè)儀中觀察MSC<'RL>細(xì)胞的遷移情況，并于預(yù)定時(shí)間將動(dòng)物脫頸處死后取腦組織做冰凍切片，熒光下觀察細(xì)胞的遷移情況。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs在體外無自發(fā)遷移的特性，而在Transwell板底層的小室中加入9L細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，MSCs細(xì)胞發(fā)生遷移，且遷移能力與9L細(xì)胞的數(shù)目呈正相關(guān)。通過活體動(dòng)物體內(nèi)成像同樣觀察到膠質(zhì)瘤裸鼠接種MSC<'RL>細(xì)胞后0天多集中于注射部位，而第7天時(shí)，可發(fā)現(xiàn)MSC<'RL>

13、細(xì)胞向中線遷移，原注射部位細(xì)胞減少，光子量減低；注射后第14天，可見部分細(xì)胞已遷移到原注射部位對(duì)側(cè)，即腫瘤側(cè)。而未接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的動(dòng)物MSC<'RL>細(xì)胞則多位于注射原部位，未發(fā)生遷移。動(dòng)物檢測(cè)結(jié)束后，脫頸處死，將腦組織冰凍切片熒光顯微鏡下可觀測(cè)到攜帶有綠色熒光蛋白的MSCs遷移到腫瘤組織周圍，在腫瘤與正常腦組織的邊界分布較多。 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)作用的實(shí)驗(yàn)研究 首先觀察體外MSCs對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影

14、響。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種9L<'luc>大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，1.3×10<'5>/孔進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)或應(yīng)用9L<'luc>大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞及MSCs或HEK細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。在普通顯微鏡下計(jì)各孔細(xì)胞總數(shù)，熒光顯微鏡下計(jì)9 L<'luc>細(xì)胞數(shù)，然后胰蛋白酶消化細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別計(jì)數(shù)各孔熒光細(xì)胞數(shù)。 在體觀察MSCs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，在F344大鼠顱內(nèi)接種9 L<'luc>細(xì)胞后7天，通過立體定向方法分別于膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤原

15、位(即前囟中點(diǎn)后1.0mm，矢狀縫右旁開3.0mm，深度為4mm)、同側(cè)腦室(前囟中點(diǎn)后3.0mm，矢狀縫右旁開1.0mm，深度為2mm)、對(duì)側(cè)腦實(shí)質(zhì)(前囟中點(diǎn)后1.0mm，矢狀縫左旁開3.0mm，深度為4mm)及股靜脈接種MSCs細(xì)胞。于接種MSCs細(xì)胞后0，7，14天通過BLI在體觀察MSCs對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響。檢測(cè)結(jié)束后，灌注固定，以注射部位為中心切取腦組織，行HE常規(guī)染色和CD<,4>、CD<,8>的免疫組化染色，于光鏡下觀察形

16、態(tài)學(xué)變化及大鼠腦內(nèi)CD<,4>，CD<,8>淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 本研究通過將9 L<'luc>與MSCs或HEK細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)9 L<'luc>細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)3天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)9L<'luc>細(xì)胞數(shù)為1.0925±0.068×10<'6>；與HEK細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，9 L<'luc>細(xì)胞數(shù)為1.97±0.150×10<'6>；而與MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，9L<'luc>細(xì)胞數(shù)為0.14±0.016×10<'6>，表明膠質(zhì)

17、瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.01)。在體研究同樣觀察到MSCs抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。將F344大鼠顱內(nèi)接種9L<'luc>細(xì)胞7天后，采用不同方式移植MSCs細(xì)胞，細(xì)胞移植后0，7，14天通過BLI檢測(cè)觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。MSCs細(xì)胞移植當(dāng)時(shí)檢測(cè)各組動(dòng)物腫瘤的生長(zhǎng)基本均衡；于MSCs移植后7天，與對(duì)照組相比，接受MSCs治療的動(dòng)物膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)速度有所增快，但移植后14天腫瘤卻比第7天明顯縮小，部分動(dòng)物腫瘤甚至檢測(cè)不到。同時(shí)本研究采用免

18、疫組織化學(xué)的方法觀察到在未接受MScs治療的9L<'luc>/F344膠質(zhì)瘤大鼠中未見CD<,4>、CD<,8>陽性細(xì)胞；而在給予MsCs治療的膠質(zhì)瘤大鼠，腫瘤組織內(nèi)CD<,4>，CD<,8>陽性淋巴細(xì)胞多見，浸潤(rùn)明顯。 結(jié)論：本研究通過制造大鼠的腦膠質(zhì)瘤模型并觀察MSCs在體及離體對(duì)腫瘤的遷移及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用發(fā)現(xiàn)MSCs細(xì)胞可以向膠質(zhì)瘤遷移，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫細(xì)胞或自身分泌的細(xì)胞因子有關(guān)，