5-氮雜脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的作用及機(jī)理研究.pdf

1、卵巢癌化療藥物耐藥是卵巢癌治療失敗的主要原因,很大程度上影響卵巢癌患者的預(yù)后,而MDR1和MRP基因過表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象的常見機(jī)制。大量研究表明,在惡性增殖的腫瘤細(xì)胞中,表觀遺傳學(xué)修飾與細(xì)胞的獲得性耐藥和原發(fā)性耐藥密切相關(guān),DNA甲基化,基因缺失及基因突變都可以作為抑癌基因失活的原因。DNA甲基化修飾最主要的表現(xiàn)之一就是一些基因啟動(dòng)子中CpG島的甲基化修飾。多藥耐藥基因(multidrug resistance MDR

2、1)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,多種轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白等都參與MDR1基因的表達(dá)調(diào)控,MDR1基因啟動(dòng)子的表觀遺傳學(xué)調(diào)控也影響其表達(dá),另外還有多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug-resistanc related protein MRP)等相關(guān)耐藥分子也參與其中。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用于卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CP70,觀察細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性及耐藥蛋白P-gp、MRP的表達(dá)變化情況以及其基因甲基化的狀態(tài),探討5

3、-氮雜脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine 5-aza-dC)對(duì)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CP70耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其作用機(jī)制。
　　【目的】
　　1.探討去甲基化劑5-氮雜脫氧胞苷對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70作用。
　　2.探討去甲基化劑5-氮雜脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的可能機(jī)制。
　　【方法】
　　1.培養(yǎng)卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株A2780及卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CP70,用免疫細(xì)胞化學(xué)、Wester

4、nblot、熒光定量PCR的方法觀察多藥耐藥(MDR1)基因和多耐藥相關(guān)蛋白(MRP)表達(dá)情況,檢測(cè)與多藥耐藥基因及蛋白相關(guān)的信號(hào)通路的活化并探討與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。
　　2.用不同濃度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)的5-Aza-dC作用于卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CP70,MTT法檢測(cè)逆轉(zhuǎn)耐藥作用。
　　3.應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)5-Aza-dC使用前后CP70細(xì)胞多藥耐藥(MDR1)、多

5、藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)基因以及啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。熒光定量PCR法及Western blot法檢測(cè)用藥前后MDR1、MRP基因mRNA及蛋白表達(dá)的變化。繼而應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)使用5-Aza-dC前后PI3K-AKT信號(hào)通路的活化狀態(tài)。探討MDR1、MRP的表達(dá)與其基因甲基化狀態(tài)以及PI3K-AKT信號(hào)通路的相關(guān)性,并探討5-Aza-dC逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥的可能機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.P-gP蛋白和

6、MRP蛋白在卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株A2780和CP70中均有表達(dá),但在卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70中表達(dá)均高于卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株A2780。
　　免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot、熒光定量PCR均顯示MDR1、MRP基因表達(dá)的蛋白及mRNA在卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70中均高表達(dá),提示,P-gP蛋白和MRP蛋白的表達(dá)與在卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示,MDR1和MRP在CP70中的表達(dá)上升伴隨著PI

7、3K-AKT信號(hào)通路的激活。
　　3.用不同濃度的5-Aza-dC作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70后,對(duì)順鉑的敏感性增加。
　　MTT法檢測(cè)5-Aza-dC作用CP70細(xì)胞前后,對(duì)順鉑的耐藥倍數(shù)明顯下降,且呈濃度依賴性,提示,5-Aza-dC可逆轉(zhuǎn)卵巢癌CP70耐藥細(xì)胞株的耐藥性。
　　4.A2780細(xì)胞中MDR1、MRP基因的甲基化修飾程度低于CP70耐藥細(xì)胞株,在使用5-Aza-dC作用CP70細(xì)胞以后MDR1、MR

8、P基因甲基化修飾程度下降。我們進(jìn)一步檢測(cè)了兩種基因的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),A2780細(xì)胞中兩種基因啟
　　動(dòng)子區(qū)域有甲基化修飾,而耐藥細(xì)胞株CP70細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化狀態(tài),在使用5-Aza-dC以后CP70細(xì)胞中兩種基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度沒有變化。CP70細(xì)胞中P-gP、MRP蛋白水平在加入5-aza-dC前后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),但在不同濃度5-aza-dC作用的CP70細(xì)胞中其表達(dá)差異不明顯(P>0.0

9、5),卵巢癌順鉑耐藥株CP70經(jīng)5-aza-dC作用后P-GP、MRP蛋白及其mRNA均表達(dá)降低。即A2780細(xì)胞中MDR1、MRP表達(dá)較低,MDR1、MRP基因啟動(dòng)子有甲基化修飾,而CP70細(xì)胞MDR1、MRP表達(dá)較高,MDR1、MRP基因啟動(dòng)子無甲基化修飾,用5-aza-dC作用于CP70細(xì)胞后MDR1、MRP表達(dá)下降,但其基因也顯示非甲基化修飾。
　　5.用不同濃度的5-Aza-dC作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70后,PI3K

10、-AKT信號(hào)通路激活受到抑制。
　　Western blot法檢測(cè)5-aza-dC作用CP70細(xì)胞前后,PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀況,結(jié)果提示,5-Aza-dC也可能通過抑制PI3K-AKT信號(hào)通路的激活逆轉(zhuǎn)卵巢癌CP70耐藥細(xì)胞株的耐藥性。
　　【結(jié)論】
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MDR1、MRP基因編碼的蛋白P-gP、MRP高表達(dá)與卵巢癌耐藥相關(guān),而P-gP、MRP高表達(dá)與其基因及基因啟動(dòng)子區(qū)域有無甲基化修飾相關(guān),5-Az

11、a-dC能抑制P-gP、MRP的進(jìn)一步表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)CP70細(xì)胞耐藥性,對(duì)基因的甲基化水平有一定影響,但并未改變MDR1、MRP基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),5-Aza-dC可以抑制PI3K-AKT信號(hào)通路的激活,而該信號(hào)通路的激活與MDR1、MRP的高表達(dá)相關(guān)。因此我們推測(cè),5-Aza-dC可能通過誘導(dǎo)基因甲基化狀態(tài)發(fā)生變化,并且通過某種途徑抑制PI3K-AKT的活性調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)CP70細(xì)胞耐藥性,但其具體