大黃素逆轉卵巢癌細胞耐藥及抑制侵襲作用機制的實驗研究.pdf

1、研究背景： 大黃素（Emodin）屬蒽醌類衍生物，是大黃、虎杖、首烏等多種中藥的有效成分之一，除了具有調節(jié)機體免疫，抗菌抗炎等作用外，近年來研究表明，大黃素還具有誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉移等多種生物學效應。隨著研究的逐步深入，其抗腫瘤作用越來越受到人們的重視。 卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是婦科中的常見惡性腫瘤，其死亡率居婦科腫瘤首位。手術治療和以紫杉醇、順鉑等為主的聯合化療方案是目前卵巢癌治療的

2、重要手段。而在臨床治療過程中會出現由于長期治療而導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，約80％以上的卵巢癌患者在治療后會出現腫瘤病灶的侵襲和轉移，從而導致腫瘤復發(fā)，五年存活率僅45％。如何逆轉卵巢癌細胞的耐藥及抑制卵巢癌侵襲轉移等問題成為卵巢癌治療的熱點和難點。 紫杉醇（Paclitaxel）是卵巢癌化療的一線藥物，作用機理是誘導和促進微管的裝配，使微管在有絲分裂時不能形成紡錘體和紡錘體絲，導致快速分裂的腫瘤細胞在有絲分裂階段（G2

3、/M期阻滯）固定，阻止腫瘤細胞的分裂和繁殖，誘導細胞凋亡。 本研究分為兩部分： 第一部分：大黃素對卵巢癌細胞系誘導凋亡和逆轉耐藥作用及機制的研究； 第二部分：大黃素對卵巢癌耐藥細胞系侵襲能力的抑制作用及其機制研究。 第一部分：大黃素對卵巢癌細胞系誘導凋亡和逆轉耐藥作用及其機制的研究 目的： 1.研究大黃素（Emodin）作用于人卵巢癌細胞系A2780和A2780/taxol細胞的生長抑制作

4、用； 2.研究大黃素對卵巢癌細胞的凋亡誘導作用；觀察大黃素對紫杉醇誘導耐藥細胞系A2780/taxol凋亡的變化； 3.檢測大黃素作用前后卵巢癌細胞中耐藥及凋亡相關基因及蛋白的表達水平，探討大黃素的作用機制。 方法： MTT法檢測不同濃度大黃素（10，20，40，80μM）對A2780和A2780/taxol的生長抑制作用；MTT法檢測低濃度大黃素聯合紫杉醇作用時，對紫杉醇抑制耐藥卵巢癌細胞A2780/t

5、axol生長的增強作用；流式細胞儀（FCM）檢測大黃素單獨或聯合紫杉醇作用于耐藥卵巢癌細胞A2780/taxol的凋亡誘導情況；QRT-PCR檢測大黃素作用后A2780/taxol細胞內MDR-1、XIAP和survivin基因mRNA表達；蛋白印跡法（Western blot）檢測A2780和A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP和survivin蛋白的表達，并檢測大黃素作用后A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP

6、和survivin蛋白表達；羅丹明外排實驗檢測P-gp功能水平的改變。 結果： 1、大黃素對A2780和A2780/taxol細胞的生長抑制作用 應用MTT法檢測不同濃度大黃素作用于卵巢癌細胞系A2780和A2780/taxol24小時后的生長抑制作用，結果顯示：A2780細胞各組細胞增殖率分別為：空白對照組99.81％±3.43％：大黃素10μM組93.85％±4.21％；大黃素20μM組78.17％±1.26

7、％；大黃素40μM組55.90％±7.00％；大黃素80μM組38.91％±3.68％。A2780/taxol細胞各組細胞增殖率分別為：空白對照組98.63％±4.61％；大黃素10μM組93.10％±5.13％；大黃素20μM組75.61％±3.82％；大黃素40μM組57.76％±6.30％：大黃素80μM組36.21％±4.50％。 2、大黃素對A2780和A2780/taxol細胞的凋亡誘導作用 應用FCM法檢測

8、不同濃度大黃素作用于卵巢癌細胞系A2780/taxol24小時后的凋亡誘導作用，結果顯示各組細胞凋亡率分別為：空白對照組1.30％；10μM大黃素組5.56％；20μM大黃素組17.66％；40μM大黃素組31.96％；80μM大黃素組41.97％。 3、大黃素與紫杉醇對A2780和A2780/taxol細胞的聯合作用 應用MTT法檢測大黃素（10μM）和紫杉醇（1μM）單獨或聯合作用于卵巢癌細胞系A2780和A2780

9、/taxol24小時后的生長抑制作用，結果顯示，A2780細胞各組細胞增殖率分別為：空白對照組100.00％±3.23％；大黃素10μM組95.00％±3.86％：紫杉醇1μM組56.45％±2.93％；大黃素+紫杉醇組43.29％±2.43％。細胞各組細胞增殖率分別為：空白對照組98.80％±3.17％；大黃素10μM組92.34％±1.07％；紫杉醇1μM組81.49％±4.49％；大黃素+紫杉醇組63.60％±2.27％。

10、 4、A2780和A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP和survivin的基礎表達 應用Western blot法檢測處于對數生長期的A2780和A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP和survivin的基礎表達，結果顯示：MDR-1所編碼的P-gp蛋白的表達在A2780細胞中非常低，但在A2780/taxol細胞中表達明顯升高。A2780/taxol細胞中，凋亡抑制蛋白家族的survivin和XIAP的表

11、達也比在其親本細胞A2780中表達明顯升高。 5、大黃素對A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP和survivin基因及蛋白表達水平的影響應用QRT-PCR和Western blot法檢測大黃素作用后A2780/taxol細胞中MDR-1、XIAP和survivin的表達水平，QRT-PCR結果用目的基因和內參照基因（β-actin）的比值來表示。結果顯示：空白對照A2780/taxol細胞中MDR-1基因水平為1.2

12、0±0.25，大黃素10μM干預72小時后A2780/taxol細胞中MDR-1基因水平為0.27±0.09（P<0.05）；空白對照A2780/taxol細胞中XIAP基因水平為1.77±0.41，大黃素10μM干預72小時后A2780/taxol細胞中XIAP基因水平為0.987±0.20（P<0.05）；空白對照A2780/taxol細胞中survivin基因水平為0.086±0.01，大黃素10μM干預72小時后A2780/ta

13、xol細胞中survivin基因水平為0.06±0.01（P<0.05）。Western blot的結果顯示大黃素作用后MDR-1、XIAP和survivin蛋白的表達水平降低。羅丹明實驗表明大黃素作用后A2780/taxol細胞中P-gp蛋白的功能為空白對照細胞的32.11％±8.8％（P<0.05）。 結論： 1、大黃素可以抑制A2780和A2780/taxol細胞的增殖，具有濃度依賴性； 2、大黃素能誘導A

14、2780和A2780/taxol細胞凋亡，通過降低MDR-1、XIAP和survivin的表達，增強紫杉醇耐藥細胞對紫杉醇的藥物敏感性并促進紫杉醇誘導的細胞凋亡。 第二部分大黃素對卵巢癌耐藥細胞系侵襲能力的抑制作用及其機制研究 目的： 1、探討A2780/taxol細胞侵襲能力的改變及相關機制； 2、檢測大黃素對卵巢癌A2780/taxol細胞的侵襲抑制作用；并探討大黃素抑制腫瘤細胞侵襲能力的作用機制。

15、 方法： 腫瘤細胞侵襲實驗（Transwell）檢測A2780和A2780/taxol兩種細胞的侵襲能力；Western blot法檢測侵襲轉移相關因子MIF、MMP-2和MMP-9在A2780和A2780/taxol細胞中基礎表達的差異；Transwell法檢測不同濃度大黃素（20，40，80μM）作用后卵巢癌A2780/taxol細胞體外侵襲能力的改變；QRT-PCR法檢測大黃素作用前后A2780/taxol細胞中MI

16、F、MMP-2和MMP-9基因mRNA表達水平的變化；Western-blot法檢測大黃素作用前后A2780/taxol細胞中MIF、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的變化。 結果： 1、A2780和A2780/taxol細胞的侵襲能力的檢測 應用Transwell法檢測處于對數生長期的A2780和A2780/taxol細胞的侵襲能力，結果顯示：每高倍鏡視野中有48±4.64個A2780細胞穿透基底膜層，進入侵

17、襲小室下層；每高倍鏡視野有92.33±7.40個細胞穿透基底膜，進入侵襲小室下層，差異有統計學意義（JP<0.05）。 2、A2780和A2780/taxol細胞中MIF、MMP-2和MMP-9的表達水平 3、大黃素對卵巢癌A2780/taxol細胞侵襲能力的影響 4、大黃素作用于卵巢癌A2780/taxol細胞后MIF、MMP-2和MMP-9的表達 結論： 1、卵巢癌細胞A2780/taxol的