人類皰疹病毒8型ORF57片段的表達(dá)純化及抗體制備.pdf

1、ORF57是人類皰疹病毒8型（human herpesvirus8，HHV-8）病毒裂解周期基因表達(dá)的一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白。HHV-8ORF57在細(xì)胞裂解感染時(shí)表達(dá)，并且它對(duì)病毒的復(fù)制是必須的。ORF57促進(jìn)病毒無內(nèi)含子RNA的富集和輸出。盡管同家族的其它成員蛋白一般會(huì)抑制細(xì)胞內(nèi)RNAs剪接，HHV-8ORF57和EBVEB2相反地會(huì)刺激病毒RNA剪接來促進(jìn)病毒有內(nèi)含子基因的表達(dá)。HHV-8ORF57的這些功能不依賴于其它的病毒蛋白，卻依

2、賴于蛋白-RNA復(fù)合體中會(huì)出現(xiàn)的一些細(xì)胞內(nèi)因子。另外，ORF57可能與ORF50協(xié)同作用，特異性地反式激活一些病毒啟動(dòng)子。
　　 本文以pET28a為載體，根據(jù)蛋白親疏水性預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)結(jié)果和構(gòu)建了HHV-8ORF57九個(gè)片段目的蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。ORF57九個(gè)目的片段蛋白的表達(dá)有較大差異，其中兩個(gè)表達(dá)量極少（ORF5718-455 aa和18-369 aa），兩個(gè)表達(dá)的大量蛋白以不溶性的包涵體形式出現(xiàn)（112-455 aa和112

3、-369 aa），三個(gè)表達(dá)的蛋白出現(xiàn)了多條降解帶（18-135 aa、18-159 aa和18-197aa），選擇表達(dá)情況較好的兩個(gè)（88-197 aa和112-197 aa）來大量表達(dá)目的蛋白并制備了相應(yīng)的多克隆抗體anti-ORF57(88-197)和anti-ORF57(112-197)。在對(duì)兩個(gè)目的蛋白作大量純化的過程中發(fā)現(xiàn)，提高純化過程中結(jié)合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液中的NaCl濃度不僅能夠提升目的蛋白純化的純度，并且還防

4、止了過夜透析后目的蛋白聚集形成許多白色沉淀。所制備的anti-ORF57(88-197)抗體在抗原上樣量50ng情況下，當(dāng)稀釋度達(dá)到1∶32000時(shí)表現(xiàn)出良好的特異性，當(dāng)稀釋度達(dá)到1∶64000時(shí)仍能檢測(cè)到目的蛋白。anti-ORF57(112-197)抗體在抗原上樣量15 ng情況下，當(dāng)稀釋度達(dá)到1∶8000時(shí)表現(xiàn)出良好的特異性，當(dāng)稀釋度達(dá)到1∶64000時(shí)仍能檢測(cè)到目的蛋白。本文的工作為HHV-8ORF57的表達(dá)研究積累了實(shí)驗(yàn)材料。