人類皰疹病毒8型ORF57片段的表達純化及抗體制備.pdf

1、ORF57是人類皰疹病毒8型（human herpesvirus8，HHV-8）病毒裂解周期基因表達的一個多功能調(diào)節(jié)蛋白。HHV-8ORF57在細胞裂解感染時表達，并且它對病毒的復制是必須的。ORF57促進病毒無內(nèi)含子RNA的富集和輸出。盡管同家族的其它成員蛋白一般會抑制細胞內(nèi)RNAs剪接，HHV-8ORF57和EBVEB2相反地會刺激病毒RNA剪接來促進病毒有內(nèi)含子基因的表達。HHV-8ORF57的這些功能不依賴于其它的病毒蛋白，卻依

2、賴于蛋白-RNA復合體中會出現(xiàn)的一些細胞內(nèi)因子。另外，ORF57可能與ORF50協(xié)同作用，特異性地反式激活一些病毒啟動子。
　　 本文以pET28a為載體，根據(jù)蛋白親疏水性預測設計結果和構建了HHV-8ORF57九個片段目的蛋白的原核表達質(zhì)粒。ORF57九個目的片段蛋白的表達有較大差異，其中兩個表達量極少（ORF5718-455 aa和18-369 aa），兩個表達的大量蛋白以不溶性的包涵體形式出現(xiàn)（112-455 aa和112

3、-369 aa），三個表達的蛋白出現(xiàn)了多條降解帶（18-135 aa、18-159 aa和18-197aa），選擇表達情況較好的兩個（88-197 aa和112-197 aa）來大量表達目的蛋白并制備了相應的多克隆抗體anti-ORF57(88-197)和anti-ORF57(112-197)。在對兩個目的蛋白作大量純化的過程中發(fā)現(xiàn)，提高純化過程中結合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液中的NaCl濃度不僅能夠提升目的蛋白純化的純度，并且還防

4、止了過夜透析后目的蛋白聚集形成許多白色沉淀。所制備的anti-ORF57(88-197)抗體在抗原上樣量50ng情況下，當稀釋度達到1∶32000時表現(xiàn)出良好的特異性，當稀釋度達到1∶64000時仍能檢測到目的蛋白。anti-ORF57(112-197)抗體在抗原上樣量15 ng情況下，當稀釋度達到1∶8000時表現(xiàn)出良好的特異性，當稀釋度達到1∶64000時仍能檢測到目的蛋白。本文的工作為HHV-8ORF57的表達研究積累了實驗材料。