偽狂犬病毒及牛皰疹病毒5型的microRNA表達(dá)譜研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)及牛皰疹病毒5型(BHV-5)屬于α皰疹病毒亞科成員，分別引起豬的Aujeszky病及犢牛的腦膜腦炎，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒編碼的miRNA在皰疹病毒的生活史及病原宿主互作中起到非常重要的調(diào)控作用，而目前對(duì)于PRV及BHV-5所編碼的miRNA研究甚少。本研究旨在鑒定兩種病毒的miRNA表達(dá)譜，并對(duì)它們?cè)诟髯詽摲腥炯安≡拗骰プ髦锌赡艿墓δ苓M(jìn)行探討。
　　 將PRV及BHV-5分別接種豬腎傳代細(xì)胞

2、系(PK-15)及牛腎傳代細(xì)胞系(MDBK)，在不同時(shí)間點(diǎn)收毒并提取總RNA。采用solexa測(cè)序技術(shù)，northern blot和stem-loop RT-PCR鑒定兩種病毒的miRNA表達(dá)譜。利用生物信息學(xué)方法，分析病毒miRNA針對(duì)自身及宿主靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及病毒感染對(duì)宿主miRNA表達(dá)譜的影響。
　　 高通量測(cè)序結(jié)果顯示PRV的LLT基因中約4.6kb的內(nèi)含子作為一個(gè)初級(jí)pri-miRNA，是一個(gè)能夠編碼11個(gè)不同mi

3、RNA的miRNA簇。其中7個(gè)為新鑒定的PRV所編碼的miRNA。通過(guò)stem-loop RT-PCR和northern blot對(duì)它們進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。在感染PRV后的PK-15中檢測(cè)到209個(gè)已知的和39個(gè)新的豬源miRNA。所有病毒miRNA在其5’及3’末端都展現(xiàn)出末端變化性，在7個(gè)病毒pre-miRNA的兩個(gè)臂端都檢測(cè)到成熟的miRNA，兩個(gè)病毒pre-miRNA部分重疊。此外，一個(gè)來(lái)自于末端莖環(huán)處且高豐度表達(dá)的sRNA以及一

4、個(gè)組織特異性表達(dá)的moRNA來(lái)自同一個(gè)病毒pre-miRNA(prv-miR-8)。靶基因分析結(jié)果揭示病毒miRNA能夠調(diào)控眾多自身及宿主的靶基因而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)宿主靶基因的GO富集分析表明PRV編碼的miRNA能調(diào)控復(fù)雜的胞內(nèi)通路，例如細(xì)胞死亡、免疫系統(tǒng)進(jìn)程和代謝通路。
　　 研究結(jié)果證實(shí)在BHV-5基因組上的17個(gè)位點(diǎn)編碼11個(gè)不同的miRNA，能產(chǎn)生16個(gè)成熟的miRNA及miRNA*。與BHV-1編碼的miRNA

5、相比，兩者都有數(shù)個(gè)miRNA分別分布在UL區(qū)和重復(fù)區(qū)，但僅有一個(gè)序列保守的miRNA。在BHV-5感染前后的MDBK細(xì)胞中，分別鑒定出285個(gè)和339個(gè)已知的牛源miRNA；此外分別鑒定出336個(gè)和327個(gè)新的牛源miRNA。BHV-5感染能顯著改變宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，在有表達(dá)差異的137個(gè)牛源miRNA中有31個(gè)顯著下調(diào)，44個(gè)顯著上調(diào)。靶標(biāo)分析及GO分析顯示這些差異表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)控各種靶基因而牽涉到各種細(xì)胞進(jìn)程。BHV