軟骨干-祖細(xì)胞的特性及其促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的研究.pdf

1、背景：
　　 關(guān)節(jié)表面透明軟骨組織具有無神經(jīng)、無血管的解剖結(jié)構(gòu)特征以及緩沖承受人體壓力的功能特征，其自我修復(fù)和再生能力很差。而關(guān)節(jié)軟骨缺損是一類常見疾病，常由運(yùn)動損傷造成，患者多為年輕人，運(yùn)動員尤為常見。缺損軟骨長期磨損會導(dǎo)致退行性的骨關(guān)節(jié)病變，隨時(shí)間推移發(fā)展為全骨關(guān)節(jié)炎。我國骨關(guān)節(jié)炎的患者約有1億人且呈不斷增加趨勢，其中85-90％都采取保守治療，10-15%的嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎患者需置換人工關(guān)節(jié)。由于極高的患病率和致殘率，昂貴的治

2、療費(fèi)用，疾病所致的工作能力和生活能力的喪失，骨關(guān)節(jié)炎已成為造成經(jīng)濟(jì)損失和影響社會發(fā)展的主要疾病之一。
　　 目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎主要采用對癥治療，關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)腔沖洗，骨髓刺激或自體軟骨塊移植，這些方法各有利弊。對癥治療，關(guān)節(jié)腔沖洗，骨髓刺激等處理方式效果迅速而顯著，但有效持續(xù)時(shí)間短暫；自體軟骨塊移植適合于小面積缺損，但移植的軟骨塊不能與周圍的軟骨愈合，長期療效無法確定。
　　 近10年隨著組織工程的興起，臨床醫(yī)學(xué)正步入“

3、再生醫(yī)學(xué)”的新階段。臨床上已成功利用自體軟骨細(xì)胞進(jìn)行缺損軟骨組織的再生治療。種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是組織工程修復(fù)再生的三大主導(dǎo)因素。在利用組織工程化軟骨再生的過程中，決定其成敗的首要因素是種子細(xì)胞。利用自體軟骨細(xì)胞移植有諸多限制，首要問題是成體軟骨細(xì)胞來源有限。軟骨細(xì)胞屬于增殖能力極弱的終末分化的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生去分化現(xiàn)象，喪失其成軟骨能力，因此難以用少量的成體軟骨細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得大量有正常功能的軟骨細(xì)胞，從而限制

4、了自體軟骨組織工程的臨床應(yīng)用。其次是，由臨床自體軟骨細(xì)胞關(guān)節(jié)移植病例的追蹤和回訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)關(guān)節(jié)修復(fù)部位，活檢組織中的均一性透明軟骨的比例為40-60%，纖維軟骨的比例占30%-40%，這可能是由于植入的軟骨細(xì)胞的個(gè)體性能差異，有些細(xì)胞能夠形成透明軟骨，有些只形成纖維軟骨。因此，如何提高均一性透明軟骨在修復(fù)軟骨中的比例也是自體軟骨組織工程臨床應(yīng)用的難題。
　　 為解決種子細(xì)胞來源不足的問題，干細(xì)胞(StemCell)憑借其自

5、我更新能力(Selfrenewal)和多向分化潛能(Pluripotent)的特征，吸引研究者的視線。胚胎干細(xì)胞和iPSCs具有軟骨分化能力，有治療軟骨缺損的可能性，研究還處于初期階段。成體干細(xì)胞用在軟骨組織再生的研究集中在滑膜和骨髓來源的干細(xì)胞。
　　 有研究表明，軟骨組織中可能存在具有多能特性的干細(xì)胞：將軟骨細(xì)胞在體外低密度種植，有部分細(xì)胞表現(xiàn)出成集落的特性。2009年KoellingS所在的德國研究組在定義了軟骨祖細(xì)胞(C

6、PC，CartilageProgenitorCell)，該研究將從末期關(guān)節(jié)炎(OA，Osteoarthritis)的軟骨組織中分離出來的具有祖細(xì)胞特征的細(xì)胞稱為軟骨祖細(xì)胞。在這一研究中無法為CPC提供明確的分離標(biāo)記，在正常軟骨組織中遵循其定義則無法分離出CPC。正常軟骨組織中是否有干細(xì)胞？其干細(xì)胞是何種來源，有何種特性？人們對軟骨組織中的這些多能干細(xì)胞的特性、起源及其應(yīng)用前景都不清楚。
　　 本研究中著重關(guān)注了軟骨干/祖細(xì)胞的存

7、在、特征、起源，以及調(diào)控軟骨干/祖細(xì)胞生長分化的因素以及其臨床應(yīng)用的探索。而這些科學(xué)問題的明晰將有助于認(rèn)識軟骨組織的干/祖細(xì)胞，從新視角了解骨關(guān)節(jié)軟骨的病理生理以及提升軟骨缺損的細(xì)胞治療質(zhì)量。
　　 具體研究分為五部分：
　　 (1)種子細(xì)胞(CSPCs)的分離和鑒定；(2)CSPCs的起源和特征；(3)CSPCs的生長分化調(diào)控，CSPCs在炎癥條件下的病理反應(yīng)及對策的研究；(4)構(gòu)建組織工程化軟骨：包括生物活性支架材料

8、的選擇、BMP家族中軟骨生長因子的優(yōu)化、利用軟骨干/祖細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨；(5)組織工程化軟骨的臨床應(yīng)用。
　　 第一章種子細(xì)胞(CSPCs)的分離和鑒定研究
　　 目的：軟骨干/祖細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的，來源于軟骨組織的干細(xì)胞。本部分的目的是研究軟骨干/祖細(xì)胞的分離收獲方案及與骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)相比較，檢測其表面標(biāo)記表達(dá)譜，和三系分化能力有何異同。
　　 方法與結(jié)果：在體外試驗(yàn)中，我們優(yōu)化了軟骨干/

9、祖細(xì)胞的培養(yǎng)方案，評估了軟骨干/祖細(xì)胞的克隆形成能力，并與骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞定量比較了三系分化能力。結(jié)果顯示，1)低密度、低葡萄糖濃度的培養(yǎng)條件能夠促進(jìn)軟骨干/祖細(xì)胞的增殖。2)軟骨干/祖細(xì)胞符合間質(zhì)干細(xì)胞的特征，包括表達(dá)特定的間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物，具有克隆形成能力，具有間質(zhì)三系分化潛能。3)與骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞相比，軟骨干/祖細(xì)胞成軟骨能力有優(yōu)勢，而骨系和脂肪系分化能力則不如骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：來源于軟骨組

10、織的軟骨干/祖細(xì)胞(CSPCs)具有間質(zhì)干細(xì)胞的共性和一些軟骨組織特性，可能是體內(nèi)軟骨修復(fù)的理想外源性種子細(xì)胞來源。
　　 第二章軟骨干/祖細(xì)胞的動態(tài)特征研究
　　 目的：研究軟骨干/祖細(xì)胞在正常人和骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者的軟骨組織內(nèi)的起源過程及其動態(tài)變化特征。
　　 方法與結(jié)果：收獲正常人和骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織，在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平，分別對軟骨組織的特異性基質(zhì)蛋白、間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志

11、以及骨關(guān)節(jié)炎/CSPCs相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行檢測。
　　 我們發(fā)現(xiàn)，1)正常人和骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織中細(xì)胞的二型膠原表達(dá)均為陽性，CD146的表達(dá)均為陰性，但Stro-1和CD271則僅表達(dá)于骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中；2)無論是正常人或骨關(guān)節(jié)炎來源的軟骨，CSPCs細(xì)胞在分離和傳代過程中，透明軟骨特征蛋白二型膠原的表達(dá)在逐漸遞減，而間質(zhì)干細(xì)胞的初期表面標(biāo)志CD146的表達(dá)則隨傳代逐漸增加。
　　 結(jié)論：CSPCs從組織到培養(yǎng)過程中，其

12、生長特征，表面標(biāo)志和功能表型是一個(gè)動態(tài)變化過程。
　　 第三章軟骨干/祖細(xì)胞生長分化的病理生理因素調(diào)控研究
　　 目的：根據(jù)CSPCs定義中的遷移特性，研究骨關(guān)節(jié)炎中一些常見病理生理因素如炎癥因子和細(xì)胞外間質(zhì)成分改變對CSPCs行為的調(diào)控。
　　 方法與結(jié)果：該部分實(shí)驗(yàn)在體外檢測CSPCs在炎性病理相關(guān)條件下細(xì)胞行為和功能基因的變化。主要研究：1)炎癥因素對于CSPC的影響；2)NGF對于CSPCs的影響；3)三

13、維微環(huán)境對CSPCs成軟骨能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)，1)在炎癥因子IL-1β的存在條件下，CSPCs自身的IL-1β基因顯著上調(diào)；炎癥因子IL-1β能夠增強(qiáng)CSPCs的NGF的表達(dá)；NGF的刺激在基因水平引發(fā)了基質(zhì)基因Agn的表達(dá)降低，基質(zhì)降解酶MMP13的表達(dá)升高。2)利用Transwell模型發(fā)現(xiàn)：在NGF的刺激下，CSPCs的遷移能力有了顯著增強(qiáng)。利用干細(xì)胞體外成軟骨的Pellet模型發(fā)現(xiàn)：NGF，NGF受體抗體，NGF受體抑制劑都能

14、不同程度降低CSPCs的成軟骨能力，而NGF抗體則對于CSPCs成軟骨能力有所提升，具體表現(xiàn)在細(xì)胞核形態(tài)和基質(zhì)沉積方面。3)利用脫細(xì)胞基質(zhì)(ECM)構(gòu)建三維成軟骨模型我們發(fā)現(xiàn)，CSPCs受不同來源的基質(zhì)影響較大。CSPCs在透明軟骨來源的ECM上表現(xiàn)出更高的軟骨基質(zhì)基因，在半月板來源的ECM上則一型膠原基因升高。
　　 結(jié)論：這項(xiàng)研究闡明了炎性因子對于CSPCs遷移特性的影響，首先發(fā)現(xiàn)了NGF促CSPCs遷移作用。同時(shí)加速軟骨基

15、質(zhì)降解，利用NGF抗體部分逆轉(zhuǎn)NGF對CSPCs成軟骨能力的抑制作用。NGF抗體先前報(bào)道的能夠抑制關(guān)節(jié)炎疼痛但機(jī)制不明，本研究發(fā)現(xiàn)其能夠有效提升CSPCs的成軟骨能力，從軟骨的組織干細(xì)胞-CSPCs這一新角度顯示了NGF抗體對骨關(guān)節(jié)炎的治療潛能，為骨關(guān)節(jié)炎治療提供新思路和新證據(jù)。
　　 第四章軟骨干/祖細(xì)胞與BMP4再生軟骨研究
　　 目的：利用軟骨干/祖細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨，并優(yōu)化其生長因子及構(gòu)建方案。
　　

16、 方法與結(jié)果：本研究首先在體外對BMP家族中的有報(bào)道的具有促進(jìn)軟骨分化能力的生長因子BMP2，BMP4和BMP7進(jìn)行了檢測，基因水平顯示BMP4促進(jìn)軟骨干/祖細(xì)胞的二型膠原表達(dá)高于其他組；體外構(gòu)建的組織工程化軟骨，BMP4刺激組體積顯著大于對照組；組織學(xué)表明，BMP4刺激下的CSPCs軟骨基質(zhì)增多明顯。在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，BMP4顯著促進(jìn)其軟骨缺損再生和力學(xué)性能增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：利用軟骨干/祖細(xì)胞能夠構(gòu)建軟骨組織，軟骨干

17、/祖細(xì)胞能夠作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。生長因子BMP4能夠促進(jìn)CSPCs軟骨基質(zhì)生成，在兔膝關(guān)節(jié)模型上能促進(jìn)軟骨修復(fù)效率。
　　 第五章自體軟骨祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究
　　 目的：使用自體軟骨祖細(xì)胞移植治療大面積的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。
　　 方法與結(jié)果：對于大面積的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損(6-12cm2)的患者5例，關(guān)節(jié)鏡下獲取200mg左右關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨組織，然后采用低密度克隆形成技術(shù)擴(kuò)增軟骨祖細(xì)胞至1×107數(shù)以上，隨

18、后進(jìn)行種子細(xì)胞的安全性和功能性檢測，以及體外復(fù)合三維支架，2-3周內(nèi)進(jìn)行第二次小切口移植手術(shù)。整個(gè)過程按照衛(wèi)生部《組織工程化組織移植技術(shù)》三類醫(yī)療新技術(shù)管理規(guī)范，在獲批臨床準(zhǔn)入的浙江大學(xué)附屬醫(yī)院骨科開展。術(shù)后立即進(jìn)行被動屈伸等功能康復(fù)鍛煉，6周內(nèi)部分負(fù)重，12周全負(fù)重，隨訪時(shí)間超過2年，Lysholm、IKDC評分顯著增加，關(guān)節(jié)活動度和疼痛感明顯改善，可自由參加體育活動。
　　 結(jié)論：研究結(jié)果顯示自體軟骨祖細(xì)胞具有可以快速擴(kuò)增用