人參皂苷Rb1對神經(jīng)內(nèi)肽酶基因啟動子活性的影響.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種原發(fā)進(jìn)行性神經(jīng)元退行性疾病，是老年性癡呆癥最常見類型。研究顯示β淀粉樣前體蛋白酶解產(chǎn)生的β-淀粉樣肽（β-amyloid peptide，Aβ）寡聚體是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡損傷，進(jìn)而導(dǎo)致AD病理發(fā)展的主要毒性物質(zhì)之一。
　　 神經(jīng)內(nèi)肽酶（neprilysin， NEP）為Ⅱ型膜結(jié)合型鋅依賴肽鏈內(nèi)切酶，是腦內(nèi)降解Aβ的關(guān)鍵酶之一。在正常情況下，NEP參與腦內(nèi)低濃度Aβ的維

2、持。在病理情況下，NEP表達(dá)水平降低，Aβ合成與清除失衡，腦內(nèi)Aβ聚集。因此NEP表達(dá)水平的降低與AD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　 人參皂苷Rb1是從人參中提取的活性單體物質(zhì)，是人參作用于神經(jīng)系統(tǒng)的主要成分之一，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。我們先前的研究顯示Rb1可以明顯上調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞NEP表達(dá)水平和活性。為進(jìn)一步闡明Rb1促進(jìn)NEP表達(dá)的機(jī)制，本研究構(gòu)建了一系列NEP啟動子缺失體-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用Rb1處理其轉(zhuǎn)染的人

3、神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，探查了NEP基因5'上游啟動子區(qū)域中與Rb1影響NEP啟動子活性有關(guān)的位點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ對NEP基因啟動子-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-nep2.4進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用通用引物RVprimer3和GLprimer2對其進(jìn)行序列分析;
　　 2.用pGL3-nep2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，并用Rb

4、1對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的雙熒光素酶活性;
　　 3.用Erase-a-base System試劑盒對pGL3-nep2.4質(zhì)粒插入片段進(jìn)行5'端缺失突變，構(gòu)建一系列NEP基因啟動子缺失體-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并進(jìn)行XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切鑒定和DNA測序分析;將缺失體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，檢測其雙熒光素酶活性;
　　 4.大量挑取NEP啟動子-894 bp～-534 bp及-247 bp～-82

5、 bp片段對應(yīng)突變體庫轉(zhuǎn)化平板上的陽性克隆，并進(jìn)行XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切鑒定和DNA測序分析;用篩選獲得的前述特定范圍內(nèi)缺失體轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，檢測其雙熒光素酶活性;
　　 5.用Rb1處理-894 bp～-857 bp、-559bp～-534bp、-223 bp～-179 bp及-100bp～-82 bp對應(yīng)的8個(gè)缺失體轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞，檢測其雙熒光素酶活性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.酶切

6、后電泳及DNA測序結(jié)果顯示pGL3-nep2.4質(zhì)粒的DNA片段插入方向及序列正確;
　　 2.熒光素酶活性檢測顯示，轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞熒光素酶活性是轉(zhuǎn)染pGL3-basic的13.1倍(P＜0.01); Rb1處理可使轉(zhuǎn)染pGL3-nep2.4質(zhì)粒SH-SY5Y細(xì)胞熒光素酶活性增加，其是未處理的2.9倍(P＜0.01);
　　 3.酶切鑒定及序列分析結(jié)果顯示， NEP啟動子大范圍缺失體系列插入方向及序列正確;

7、r>　　 4.特定范圍缺失體系列轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性檢測顯示，NEP基因上游啟動區(qū)-894 bp-857 bp(RegionⅠ)及-100 bp～-82 bp(RegionⅣ)片段缺失后，啟動子活性分別是缺失前的29％(P＜0.01)和25％(P＜0.01)，-559bp～-534bp（RegionⅡ）及-223 bp～-179bp(RegionⅢ)片段缺失后，啟動子活性分別是缺失前的5.12(P＜0.01)及1.81倍(P＜0.01

8、)。
　　 5.Rb1處理后，雙熒光素酶活性檢測顯示，RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失前后缺失體體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性均與未處理的無明顯差異(P＞0.05)，RegionⅣ缺失后質(zhì)粒pGL3-226轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性也與未處理的無明顯差異(P＞0.05)，而RegionⅣ缺失前缺失體質(zhì)粒pGL3-244轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性則是未處理的1.61倍（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1.pGL3-nep2.4質(zhì)粒