人參皂苷Rb1對(duì)NF-κB調(diào)控的軟骨細(xì)胞NO生成的影響及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討人參皂苷Rb1對(duì)白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞一氧化氮(nitric oxide，NO)生成和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)表達(dá)的影響;探討人參皂苷Rb1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化的影響及其機(jī)制;探討人參皂苷Rb1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(

2、mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路活化的影響。
　　方法:
　　1.SW1353細(xì)胞分為以下5組:正常組、模型組、20μM人參皂苷Rb1組、40μM人參皂苷Rb1組、80μM人參皂苷Rb1組。各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1預(yù)作用2h后，模型組和各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1組均加入10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)24 h，Greiss反應(yīng)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO含量;提取細(xì)胞總蛋白，W

3、estern blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)。
　　2.SW1353細(xì)胞分為以下4組:正常組、20μM人參皂苷Rb1組、40μM人參皂苷Rb1組、80μM人參皂苷Rb1組。藥物作用24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　3.SW1353細(xì)胞分為以下5組:正常組、模型組、20μM人參皂苷Rb1組、40μM人參皂苷Rb1組、80μM人參皂苷Rb1組。各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1預(yù)作用2h后，模型組和各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1組

4、均加入10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo):(1)0.5h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α蛋白含量;(2)1h后，提取細(xì)胞核蛋白，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κ BP65蛋白含量;(3)1 h后，提取細(xì)胞核蛋白，ELISA法（Trans AMTM試劑盒）檢測(cè)NF-κB與DNA結(jié)合活性。
　　4.SW1353細(xì)胞分為以下5組:正常

5、組、模型組、20μM人參皂苷Rb1組、40μM人參皂苷Rb1組、80μM人參皂苷Rb1組。各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1預(yù)作用2h后，模型組和各個(gè)濃度的人參皂苷Rb1組均加入10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)20 min后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK和p38磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.正常狀態(tài)下SW1353細(xì)胞的NO分泌量為2.24±0.21μmol/L，10ng/ml IL-1β誘導(dǎo)2

6、4 h后NO產(chǎn)生量增加至41.13±2.77μmol/L，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，40μM、80μM人參皂苷Rb1減少了IL-1β誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生，分別為33.27±2.71μmol/L和29.03±3.31μmol/L，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），20μM人參皂苷Rb1作用后NO產(chǎn)生量為39.17±1.97μmol/L，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。靜息狀態(tài)下SW1353細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到

7、iNOS蛋白的表達(dá)，10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)24 h后iNOS表達(dá)量增加至1.80±0.12。40μM、80μM人參皂苷Rb1顯著減少了IL-1β誘導(dǎo)iNOS蛋白的表達(dá)，分別下降至1.01±0.27、0.79±0.11，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），20μM人參皂苷Rb1作用后iNOS蛋白的表達(dá)量為1.70±0.09，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.20μM、40μM、80μM人參皂苷Rb1作用24

8、 h后SW1353細(xì)胞存活率分別為(％)102.33±1.53、99.26±2.65、98.33±2.32，與正常組(100％)相比較均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.(1)在正常狀態(tài)下，SW1353細(xì)胞IκBα蛋白含量為2.94±0.31。10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)0.5 h后SW1353細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白含量減少至0.58±0.09，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001);40μM、80μM人參皂苷Rb1使IL-1β誘導(dǎo)0

9、.5 h后的IκB僅蛋白含量分別增加至1.76±0.27、2.12±0.20，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）;20μM人參皂苷Rb1作用后IκBα蛋白含量為0.66±0.09，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(2)在正常狀態(tài)下，SW1353細(xì)胞核內(nèi)P65含量為0.65±0.09。10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)1h后SW1353細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白含量增加至3.06±0.06，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001);40μ

10、M、80μM人參皂苷Rb1使IL-1β誘導(dǎo)后的IκBα蛋白含量分別減少至2.27±0.17、1.89±0.19，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）;20μM人參皂苷Rb1作用后細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白含量減少至3.02±0.09，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(3)在正常狀態(tài)下，SW1353細(xì)胞NF-κB與DNA結(jié)合活性為0.15±0.03。10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)1h后SW1353細(xì)胞NF-κB與DNA結(jié)合活性提高至1.4

11、8±0.20，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001);40μM、80μM人參皂苷Rb1使IL-1β誘導(dǎo)后的NF-κB與DNA結(jié)合活性分別降低至0.93±0.11、0.63±0.10，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）;20μM人參皂苷Rb1作用后NF-κB與DNA結(jié)合活性為1.47±0.12，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.正常狀態(tài)下，我們沒(méi)有檢測(cè)到SW1353細(xì)胞p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的

12、表達(dá)。10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)20 min后SW1353細(xì)胞內(nèi)p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK表達(dá)量分別為0.59±0.08、1.22±0.11、1.01±0.12;各種濃度的人參皂苷Rb1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的p-ERK、p-JNK表達(dá)沒(méi)有明顯影響;40μmol/L、80μmol/L的人參皂苷Rb1使IL-1β誘導(dǎo)的p-p38表達(dá)降低至0.43±0.09、0.40±0.04，與模型組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

13、)。20μM人參皂苷Rb1作用后p-p38表達(dá)量為0.93±0.05，與模型組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.人參皂苷Rb1可抑制IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞產(chǎn)生NO，其機(jī)制與抑制iNOS蛋白表達(dá)密切相關(guān)，且該作用不依賴于抑制細(xì)胞正常增殖。
　　2.人參皂苷Rb1抑制IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)與拮抗IκBα降解、p65蛋白核轉(zhuǎn)移和NF-κ3與DNA結(jié)合活性，從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活