影響細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷敏感性因素的研究.pdf

1、白血病是威脅人類健康的主要惡性疾病之一，目前治療措施仍以化療為主。通過大量研究發(fā)現(xiàn)影響化療效果和白血病患者長(zhǎng)期無(wú)病生存率的原因當(dāng)中，除了疾病類型及藥物毒副作用等因素以外，化療藥物的耐藥是一個(gè)重要的原因。參與急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）病人耐藥的機(jī)制有很多，其中研究較多的是多藥耐藥及與此表型相關(guān)的跨膜藥物輸出泵（例如P-gp,MRP等）的過度表達(dá)。在用蒽環(huán)類藥物和Ara-C聯(lián)合化療的AML病人，P-gp,MRP等的過度表達(dá)也導(dǎo)致了完全緩解率

2、（CR）的降低和生存時(shí)間的縮短，而有些AML病人雖沒有多藥耐藥基因的表達(dá)，但也無(wú)法達(dá)到疾病的緩解，提示可能有其它的機(jī)制參與了Ara-C的耐藥。 許多資料表明，細(xì)胞內(nèi)Ara-C的活性形式Ara-CTP的降低與臨床耐藥有密切的關(guān)系,而Ara-C代謝酶可能參與了AML病人的耐藥。Ara-C進(jìn)入細(xì)胞后主要在脫氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，DCK）的作用下生成活性Ara-CTP，后者可以整合到DNA雙鏈中并引起DN

3、A的合成受阻，最終可以使細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)的Ara-C也可在胞苷脫氨酶（cytidine deaminase，CDD)的作用下生成無(wú)活性的Ara-U排出體外。參與Ara-C的另一種重要的酶是核苷酸酶（cytoplasmic 5’-nucleotidase，5′-NT），它可以水解酯鍵使Ara-CMP脫磷酸，從而減少了Ara-CTP的聚集，引起細(xì)胞對(duì)Ara-C的敏感性降低。因此，Ara-C代謝酶的變化有可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)Ara-CTP水平的變

4、化，最終導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)Ara-C敏感性的變化。 研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ara-CTP的水平除了與細(xì)胞內(nèi)上述Ara-C代謝酶有關(guān)，還與細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)Ara-C的載體有關(guān)。Ara-C在標(biāo)準(zhǔn)劑量（100-200mg/m2）時(shí)要依賴載體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用進(jìn)入細(xì)胞，而人類平衡核苷體（hENT1）是Ara-C進(jìn)入細(xì)胞的主要載體，現(xiàn)有研究表明hENT1與Ara-C耐藥密切相關(guān)，因此，Ara-C的耐藥可能與載體的數(shù)量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率有關(guān)。 在本研究中，應(yīng)用六種血

5、液病細(xì)胞株對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ara-C代謝酶的基因表達(dá)和細(xì)胞膜上平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)進(jìn)行了分析，旨在探討Ara-C代謝酶、平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體與阿糖胞苷敏感性的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分： （一）用半定量PCR方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)六種血液病細(xì)胞內(nèi)阿糖胞苷代謝酶的表達(dá)與阿糖胞苷敏感關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明六種細(xì)胞株DCK的表達(dá)（△Ct值）與IC50值間呈正相關(guān)（r=0.88，P=0.021）。而CDD、5’NT的表達(dá)（△Ct值）和IC5

6、0值間無(wú)相關(guān)關(guān)系。 （二）用半定量PCR方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞膜上核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)與阿糖胞苷敏感關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明剔除K562細(xì)胞株，其余五種細(xì)胞膜上hENT1的表達(dá)（△Ct值）和IC50值間呈正相關(guān)（r=0.939，P=0.018）。其他亞型ENT表達(dá)（△Ct值）與IC50值間無(wú)相關(guān)關(guān)系。 （三）用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)阿糖胞苷體外作用后六種血液病細(xì)胞株阿糖胞苷代謝酶基因與核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)證