Bachl克隆構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞藥物敏感性影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　 轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC同源異構(gòu)體1(Bach1)屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族,對(duì)血紅素氧化酶1(HO-1)有特異的抑制作用,而HO-1是細(xì)胞中重要的保護(hù)酶。腫瘤細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)可以影響腫瘤的生長(zhǎng),并且可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法的敏感性。在對(duì)腫瘤組織進(jìn)行放療,化療等治療后,HO-1表達(dá)會(huì)升高。鑒于HO-1在腫瘤治療中對(duì)腫瘤細(xì)胞所起的保護(hù)作用,我們嘗試通過提高Bach1的表達(dá)來達(dá)到抑制HO-1的表達(dá)的目的,然后通過藥物敏

2、感性試驗(yàn)檢驗(yàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞中HO-1表達(dá)降低時(shí),腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)的敏感性是否有變化,會(huì)發(fā)生怎樣的變化。
　　 目的：
　　 構(gòu)建真核表達(dá)載體pBI-EGFP-Bach1,使其轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721后能降低其中HO-1的表達(dá),通過MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿敏感性是否發(fā)生變化。
　　 方法：
　　 1、用PCR的方法從質(zhì)粒pQE30-bach1擴(kuò)增目的基因Bach1,用Nh

3、eI和MluI分別雙酶切質(zhì)粒pBI-EGFP及PCR擴(kuò)增的Bach1,用T4連接酶連接,構(gòu)成重組質(zhì)粒;
　　 2、用RT-PCR鑒定Bach1基因插入成功后,將Tet-Off質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1雙轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48h后,Bach1以及HO-1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；
　　 3、用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒前后肝癌細(xì)胞SMMC-7721對(duì)長(zhǎng)春新堿的藥物敏感性是否有變化,得出各自的IC50；

4、
　　 4、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組(VCR+Bach1)和未轉(zhuǎn)染組(VCR)肝癌細(xì)胞SMMC-7721加入長(zhǎng)春新堿后Bach1和HO-1的表達(dá)；
　　 5、DNA Ladder檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組肝癌細(xì)胞SMMC-7721在低濃度長(zhǎng)春新堿作用下細(xì)胞凋亡條帶；
　　 6、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細(xì)胞在低濃度長(zhǎng)春新堿作用下的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、用NheI和MluI雙

5、酶切以及PCR鑒定表明重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1構(gòu)建成功；
　　 2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)后提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1組Bach1的mRNA表達(dá)顯著升高,同時(shí)HO-1的表達(dá)降低；
　　 3、相同劑量藥物作用下,轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pBI-EGFP-Bach1的細(xì)胞,凋亡率比未加入重組質(zhì)粒的細(xì)胞明顯升高。且在VCR濃度為0.15,0.25μg／ml的時(shí)候,p值小于0

6、.05；在藥物濃度為0.2μg／ml時(shí)p值小于0.01；未轉(zhuǎn)染組的IC50為0.15μg／ml,轉(zhuǎn)染組的IC50為0.21μg／ml。二者相比,轉(zhuǎn)染組的半數(shù)抑制濃度低于未轉(zhuǎn)染組28.6％；
　　 4、加藥后檢測(cè)兩組Bach1和HO-1的mRNA表達(dá)情況,轉(zhuǎn)染組中Bach1表達(dá)增高,而未轉(zhuǎn)染組的HO-1表達(dá)增高。且未轉(zhuǎn)染組的HO-1的表達(dá)高于陰性對(duì)照組；
　　 5、加入15μg／ml的VCR48h后提取各組DNA,電泳結(jié)果

7、顯示轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)凋亡條帶,而此劑量下未轉(zhuǎn)染組凋亡條帶不明顯；
　　 6、加入15μg／ml的VCR后未轉(zhuǎn)染組的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)上并未太大發(fā)生變化,但轉(zhuǎn)染組可觀察到大量細(xì)胞死亡,細(xì)胞體積變小變圓,細(xì)胞膜完整但有發(fā)泡情況。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子Bach1的真核表達(dá)載體pBI-EGFP-Bach1,且證實(shí)轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后Bach1基因能夠在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá),并能抑制HO