CCL20基因敲低型人角質(zhì)形成細(xì)胞克隆篩選及其長(zhǎng)期體外效應(yīng)研究.pdf

1、大面積燒傷及其他皮膚損傷患者因自體皮膚來(lái)源受限常需大量異體皮膚覆蓋創(chuàng)面。盡管異基因組織工程皮膚產(chǎn)品已初步應(yīng)用于臨床，但仍無(wú)法避免機(jī)體對(duì)其的排斥反應(yīng)?？朔@類免疫排斥反應(yīng)的關(guān)鍵技術(shù)之一就是要對(duì)種子細(xì)胞引起排斥反應(yīng)的重要靶基因進(jìn)行修飾。趨化因子CCL20通過(guò)趨化皮膚移植受者的郎格漢斯細(xì)胞在異基因組織工程皮膚移植物的排斥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系( HaCaT)不僅具有與表皮干細(xì)胞相似的表型、增殖和分化特性，而且其遺傳特性穩(wěn)

2、定、不具有成瘤性，可作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的理想候選者。若能對(duì)HaCaT的CCL20基因進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定的下調(diào)修飾，則可能達(dá)到改良組織工程皮膚種子細(xì)胞的目的。在已經(jīng)構(gòu)建成功人CCL20基因特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，本研究將利用這些載體感染HaCaT，篩選出陽(yáng)性細(xì)胞克隆，并在mRNA水平、蛋白水平及其對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的趨化效應(yīng)來(lái)檢測(cè)其對(duì)CCL20基因的干擾效果和體外效應(yīng)，預(yù)期獲得CCL20基因敲低型人角質(zhì)形成

3、細(xì)胞克隆，為制備低免疫排斥反應(yīng)的新型組織工程皮膚提供種子細(xì)胞。 目的: 1.探索不同基因轉(zhuǎn)移方法將不同大小質(zhì)粒導(dǎo)入人角質(zhì)形成細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率，為尋找人角質(zhì)形成細(xì)胞的高效基因?qū)敕椒ㄌ峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.基于前一部分的研究結(jié)果，采用慢病毒載體攜帶CCL20-shRNA對(duì)HaCaT進(jìn)行基因修飾，經(jīng)G418篩選出CCL20基因特異型HaCaT克隆和CCL20基因錯(cuò)配型HaCaT克隆，并在CCL20 mRNA水平上初步鑒

4、定其干擾效果。 3.在mRNA和蛋白水平上進(jìn)一步觀察長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的HaCaT克隆的CCL20干擾效應(yīng)。 4.采用人臍血CD34+細(xì)胞，經(jīng)不同細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)方案，觀察朗格漢斯細(xì)胞(CDla+細(xì)胞)的產(chǎn)量，并作為L(zhǎng)C趨化模型的效應(yīng)細(xì)胞，觀察HaCaT克隆對(duì)LC的趨化效應(yīng)。 方法: 1.分別采用脂質(zhì)體和陽(yáng)離子多聚物法將四種不同大小的質(zhì)粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和plox

5、P-EGFP)轉(zhuǎn)染HaCaT、HeLa和293FT，以熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 2.采用電穿孔法結(jié)合細(xì)胞系電轉(zhuǎn)試劑將四種不同大小的質(zhì)粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP)轉(zhuǎn)染HaCaT、以熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 3.采用CaCl2法在293FT包裝重組慢病毒載體pHSER-CCL20-shRNA-GFP-SIN的慢病毒顆粒，以流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒滴度，并將滴度確定的慢病毒轉(zhuǎn)染HaCaT。 4.采用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT，篩選具有細(xì)胞毒性的G418最低濃度，將慢病毒成功感染的HaCaT用有限稀釋法加樣至96孔板，并結(jié)合細(xì)胞毒性最低濃度的G418進(jìn)行壓力篩選5-8周。 5.建立體外炎性細(xì)胞因子刺激HaCaT產(chǎn)生CCL20的模型：將HaCaT接種于6孔板中，48h后更換含濃度均為100ng/ml的TNF-α和IL-1β的DK培養(yǎng)基，培養(yǎng)

7、24h后的細(xì)胞采用Trizol法提取總RNA，培養(yǎng)48h后的細(xì)胞上清被保存于-20℃?zhèn)溆谩?6.熒光定量PCR技術(shù)(qPCR):以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量。比較CCL20基因特異型HaCaT克隆和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量，觀察CCL20基因特異型克隆對(duì)CCL20的下調(diào)。 7.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)：在酶標(biāo)儀上檢測(cè)CCL20標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD450值。根據(jù)試

8、劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD450值，求出其擬合曲線和方程；將樣品OD450值代入方程，得到樣品中CCL20的蛋白濃度。比較CCL20基因特異型細(xì)胞克隆和對(duì)照組HaCaT細(xì)胞分泌CCL20的濃度，觀察CCL20基因特異型細(xì)胞克隆CCL20的下調(diào)。 8.先用人淋巴細(xì)胞分離液得到臍血單個(gè)核細(xì)胞，以CD34直接免疫磁珠法對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行直接標(biāo)記，分選和純化臍血單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞。 9.以5種不同的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)方案

9、，對(duì)分選出的CD34+細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)形態(tài)變化、集落的形成，并對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d和第12d的CD34+細(xì)胞進(jìn)行CDlα、HLA-DR等LC表型分子，以及CD40、CD80等共刺激分子表型的檢測(cè)。篩選出最佳的LC體外誘導(dǎo)方案。 10.以最佳誘導(dǎo)方案體外培養(yǎng)誘導(dǎo)得到的LC，建立體外LC的趨化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停阂訡CL20標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)對(duì)LC的趨化效應(yīng)，以驗(yàn)證趨化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性。以不同基因修飾狀態(tài)的HaCaT為對(duì)象，觀察HaCaT

10、克隆在TNF-α和IL-1β共刺激48h的細(xì)胞上清中產(chǎn)生的CCL20因子對(duì)LC的趨化效應(yīng)。 結(jié)果: 1.G418壓力篩選野生型HaCaT的最低細(xì)胞毒性濃度為400μg/ml。 2.將pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP四種質(zhì)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陽(yáng)離子多聚物和電穿孔法聯(lián)合細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HaCaT的轉(zhuǎn)染率分別為1.0～3.3％、1.0~3.7％和3.3％～22.3％；

11、采用脂質(zhì)體和陽(yáng)離子多聚物轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HeLa的轉(zhuǎn)染率分別為30.3％～35.7％和33.7％～36.7％；采用脂質(zhì)體和陽(yáng)離子多聚物轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293FT的轉(zhuǎn)染率分別為80.0％～84.7％和81.3％～86.7％。將pHSER-GFP包裝成慢病毒轉(zhuǎn)染HaCaT的轉(zhuǎn)染率為97％。 3.CCL20-shRNA慢病毒載體經(jīng)包裝后感染HaCaT，轉(zhuǎn)染率可達(dá)90％以上，經(jīng)G418壓力篩選5～8周后共獲得了38株克隆，其中HaCaT-CCL20

12、-shRNAl有12株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA2有16株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA3有10株克隆。熒光定量PCR初步檢測(cè)已傳代10～15代的28株克隆CCL20 mRNA相對(duì)量，以HaCaT為對(duì)照計(jì)算出抑制率：70％-100％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有1株)；50％-70

13、％的有4株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有3株)；0-50％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有3株。)；-293％～0％的有6株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有2株，HaCaT-

14、 CCL20-shRNA3克隆有3株。)。 4.采用熒光定量PCR和ELISA進(jìn)一步分析結(jié)果3中CCL20mRNA抑制率>50％的已傳35～45代的11株克隆， CCL20mRNA表達(dá)抑制率高達(dá)75％以上且其蛋白表達(dá)抑制率也高達(dá)85％以上的CCL20基因特異型有4株。 5.流式細(xì)胞術(shù)分析5種細(xì)胞因子方案體外誘導(dǎo)培養(yǎng)LC的結(jié)果顯示，方案IV、V誘導(dǎo)培養(yǎng)6天和12天的CDla+細(xì)胞百分率和CDla+細(xì)胞數(shù)量均明顯多于方案I、

15、II和III；方案V誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的CD80+和CD40+細(xì)胞百分率明顯高于方案IV；方案IV誘導(dǎo)培養(yǎng)12天的HLA-DR+細(xì)胞百分率顯著高于方案V。 6.按照方案IV進(jìn)行體外培養(yǎng)誘導(dǎo)LC，并用于體外趨化實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果顯示，相對(duì)于未修飾的HaCaT，炎性細(xì)胞因子刺激的CCL20基因敲低型克隆對(duì)LC趨化效應(yīng)均受抑制。 結(jié)論: 1.常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染法較難將外源性基因?qū)肴私琴|(zhì)形成細(xì)胞，慢病毒法的轉(zhuǎn)染率明顯優(yōu)于聯(lián)合細(xì)胞核轉(zhuǎn)

16、染試劑的電穿孔法，而且質(zhì)粒大小不同對(duì)導(dǎo)入的效率也有明顯的影響。 2.采用CCL20基因特異型重組慢病毒可高效率地轉(zhuǎn)染人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞( HaCaT)，經(jīng)G418篩選后可獲得CCL20基因特異型細(xì)胞克隆。 3.經(jīng)熒光定量PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)可以篩選出具有長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)RNA干擾效應(yīng)的CCL20基因特異型HaCaT細(xì)胞克隆. 4.利用細(xì)胞因子組合方案IV體外誘導(dǎo)磁珠分選的CD34+細(xì)胞，可以獲得高表達(dá)CDla+和