鈣泊三醇對人角質(zhì)形成細(xì)胞作用機制的研究.pdf

1、銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，淋巴細(xì)胞浸潤為特征、由T細(xì)胞介導(dǎo)的一種多基因遺傳背景下的免疫異常性疾病。目前銀屑病發(fā)病的確切病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，而遺傳因素和免疫因素已被證明在疾病發(fā)生和病理過程中起到了十分重要的作用，基因信號通路是近年來研究的熱點。Wnt信號通路是目前與KC增殖分化密切相關(guān)的重要信號通路，我們采用這些細(xì)胞信號通路的功能分類基因芯片研究藥物對通路關(guān)鍵靶點的影響，探討其作用機制。
　　 鈣泊三醇(Calc

2、ipotriol)是一種維生素D衍生物，相對分子量為412.605，分子式為C27H4003，屬于一種免疫抑制劑，其性狀為白色或近白色結(jié)晶粉末，不溶于水，溶于95％的乙醇，微溶于二氯甲烷，對熱和光敏感。它通過細(xì)胞核內(nèi)維生素D受體發(fā)生作用。皮膚中的角質(zhì)細(xì)胞、皮膚附屬器細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和已激活的B淋巴細(xì)胞等參與銀屑病發(fā)病的細(xì)胞中均有維生素D3受體。維生素D3類藥物與受體結(jié)合，調(diào)整了細(xì)胞內(nèi)的生物變化，抑制角質(zhì)細(xì)胞增生，增

3、強其形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)分化作用使細(xì)胞生長、繁殖按正常的規(guī)律進(jìn)行。同時，實驗研究表明，維生素D3類藥物能與皮膚炎癥和免疫應(yīng)答中細(xì)胞激肽途徑相互作用并加以調(diào)節(jié)。Calverley(1988年)首先報道其合成，作為新的抗銀屑病藥物，由丹麥LeoDenmark公司開發(fā)和生產(chǎn)，1991年3月在英國、丹麥和愛爾蘭上市。經(jīng)研究表明鈣泊三醇是角質(zhì)細(xì)胞分化和增生的強調(diào)節(jié)劑、減少銀屑病患者表皮IL-6含量及活化的表皮T淋巴細(xì)胞數(shù)，它能抑制皮膚細(xì)胞(角質(zhì)細(xì)胞)

4、的過度增生和誘導(dǎo)其分化，從而使銀屑病皮損的增生及分化異常得以糾正。主要用于治療銀屑病。
　　 Wnt信號通路RT2ProfilerTMPCR可以同時檢測與Wnt介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的89個基因表達(dá)譜。其中包括屬于Frizzled-2信號通路的19個糖基化細(xì)胞外信號分子。也包括充當(dāng)Wnt基因A(Frizzled-1信號通路成員)配體的細(xì)胞表面受體。還包括Wnt信號通路的調(diào)節(jié)基因和Wnt的競爭結(jié)合基因，細(xì)胞內(nèi)分子基因和參與細(xì)胞調(diào)控與增

5、殖的靶基因。該芯片還包含參與Wnt信號通路下游蛋白修飾的基因，包括激酶、磷酸化酶和參與泛素化的基因。
　　 Wnt信號通路是目前與KC增殖分化密切相關(guān)的重要信號通路，而Wnt信號通路RT2ProfilerTMPCR可以同時檢測與Wnt介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的89個基因表達(dá)譜。其中包括屬于Frizzled-2信號通路的19個糖基化細(xì)胞外信號分子。也包括充當(dāng)Wnt基因A(Frizzled-1信號通路成員)配體的細(xì)胞表面受體。還包括Wnt

6、信號通路的調(diào)節(jié)基因和Wnt的競爭結(jié)合基因，細(xì)胞內(nèi)分子基因和參與細(xì)胞調(diào)控與增殖的靶基因。該芯片還包含參與Wnt信號通路下游蛋白修飾的基因，包括激酶、磷酸化酶和參與泛素化的基因。我們采用這些細(xì)胞信號通路的功能分類基因芯片研究藥物對通路關(guān)鍵靶點的影響，探討其作用機制。
　　 銀屑病的致病環(huán)節(jié)錯綜復(fù)雜，致病因子之間彼此聯(lián)系形成巨大網(wǎng)絡(luò)，那么鈣泊三醇是通過怎樣的途徑發(fā)揮作用，藥物作用的靶基因與靶蛋白是哪些呢?為進(jìn)一步深入探討這些問題我們開

7、展了相關(guān)研究。運用CKK-8法、流式細(xì)胞儀檢測鈣泊三醇作用HaCaT后細(xì)胞的增殖變化情況；運用基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)分析鈣泊三醇是否通過影響Wnt信號通路，并篩選鈣泊三醇作用的差異基因和差異蛋白，為深入研究維生素D3類藥物的作用機制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分，鈣泊三醇對HaCaT細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：研究鈣泊三醇對人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株在細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：用不同濃度的鈣泊三醇(1

8、×10-11mol/L～1×10-7mol/L)刺激HaCaT細(xì)胞，用CKK-8法檢測不同濃度鈣泊三醇作用后HaCaT細(xì)胞的增殖情況。實驗分為鈣泊三醇組和空白對照組，用流式細(xì)胞儀檢測鈣泊三醇作用后，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　 結(jié)果：當(dāng)鈣泊三醇的濃度為1×10-7mol/L范圍內(nèi)時，作用48h后，CKK-8結(jié)果顯示鈣泊三醇組的吸光值較空白對照組比較顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)鈣泊三醇的濃度在1×10-11m

9、ol/L～1×10-8mol/L范圍內(nèi)時，作用48h后，結(jié)果顯示鈣泊三醇組的吸光值較空白對照組沒有顯著降低，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 鈣泊三醇作用HaCaT細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞周期中S期為34.52％，G2期為16.62％，S+G2=51.14％；空白對照組：S期為46.48％，G2期為16.70％，S+G2=63.18％。提示鈣泊三醇作用HaCaT細(xì)胞后S期和G2期細(xì)胞比例下降，但細(xì)胞凋亡無明

10、顯變化。
　　 結(jié)論：一定濃度的鈣泊三醇有抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用，分析鈣泊三醇對銀屑病的治療機制，與其抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖有關(guān)。
　　 第二部分，鈣泊三醇對HaCaT細(xì)胞Wnt信號通路的影響
　　 目的：利用PCR基因芯片技術(shù)，研究鈣泊三醇[calcipotriol]對HaCaT細(xì)胞Wnt/beta-Catenin(Wnt)信號通路的影響，探討其治療銀屑病的機制。
　　 方法：培養(yǎng)HaCaL角質(zhì)形

11、成細(xì)胞株，用鈣泊三醇處理細(xì)胞后，抽提鈣泊三醇組和空白對照組細(xì)胞的總RNA，用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA產(chǎn)量和質(zhì)量；合成cDNA，隨后與含有89條人類基因的Wnt信號通路基因芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行實時定量PCR擴增，最后對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。
　　 結(jié)果：在89條基因中，鈣泊三醇組與空白對照組比較，有25條基因表達(dá)差異達(dá)2倍以上，其中21條顯著上調(diào)，4條顯著下調(diào)。這些差異表達(dá)基因涉及細(xì)胞增殖與分化、胚胎形成，