內(nèi)源性硫化氫合成酶參與新生期母愛剝奪誘導成年大鼠內(nèi)臟過敏的外周機制研究.pdf

1、目的：
　　1.初步闡明新生期母愛剝奪(Neonatal Maternal Deprivation, NMD)誘導的成年大鼠內(nèi)臟痛過敏中脊髓背根節(jié)神經(jīng)元上電壓門控性鈉通道表達和功能的變化特征。
　　2.探討內(nèi)源性硫化氫合酶胱硫醚-b-合成酶（CBS）在慢性內(nèi)臟痛中的作用及其對電壓門控性鈉通道表達和功能調控的影響。
　　方法：
　　1.新生鼠從出生后第2天開始到第15天，處理組和母鼠分離，每天分開3個小時，對照組不

2、做處理。運用這種方法誘導大鼠的內(nèi)臟痛過敏模型。運用腹壁撤回評分（AWR score）方法評測NMD大鼠的痛行為反應。腹腔注射CBS阻斷劑羧甲基羥胺半鹽酸（AOAA），同樣運用以上腹壁撤回評分方法評測大鼠的痛行為反應，從而檢測H2S在慢性痛模型中的作用。
　　2.結腸管壁注射熒光素（DiI）來標記腸特異性背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元，運用全細胞膜片鉗方法研究大鼠腸相關神經(jīng)元興奮性及電壓依賴性鈉通道電流的變化特性。
　　3.運用W

3、estern Blotting，免疫組織化學，Quantitative Real-time PCR的實驗方法檢測大鼠腸相關DRG神經(jīng)元中NaV1.8，NaV1.9以及CBS蛋白和mRNA表達情況。
　　結果：
　　1. NMD顯著增加成年大鼠對直結腸擴張的反應性，表現(xiàn)在AWR分數(shù)的顯著增加以及痛閾的降低。腹腔注射H2S合酶CBS的拮抗劑AOAA后，可以顯著降低實驗組大鼠的AWR分數(shù)，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。
　　2.全

4、細胞膜片鉗記錄顯示，與對照組相比，NMD顯著增加腸相關DRG神經(jīng)元(T13-L2)的興奮性；進一步檢測顯示NMD顯著增加TTX-R鈉通道的電流密度，而TTX-S鈉電流密度沒有明顯變化。
　　3.數(shù)據(jù)分析后顯示，和對照組相比，NMD組的激活曲線顯著左移，而失活曲線沒有顯著變化。另外，NMD處理后，TTX-R鈉通道的激活時間顯著縮短，失活時間沒有顯著變化。
　　4. NMD處理組7周大鼠腸相關DRG神經(jīng)元（T13-L2）中，Na

5、V1.8受體蛋白表達顯著增加，腸相關DRG神經(jīng)元中NaV1.8的mRNA總量沒有顯著變化。
　　5.連續(xù)腹腔注射AOAA可以顯著翻轉NMD組大鼠腸相關DRG神經(jīng)元的興奮性，還可以顯著降低TTX-R的鈉通道的電流密度，并使TTX-R鈉通道的激活曲線右移。另外AOAA還可以顯著降低NMD引起的腸DRG神經(jīng)元中NaV1.8的高表達。
　　6.外界灌流H2S的供體NaHS,可以顯著增加正常大鼠腸相關DRG神經(jīng)元的興奮性，還可以顯著增

6、加TTX-R鈉通道的電流密度，使TTX-R鈉通道的激活曲線左移。另外，給與PKA的拮抗劑H-89可以顯著降低NaHS引起的電流密度的增加。
　　結論：
　　以上實驗結果表明H2S合酶CBS可能是通過PKA介導的TTX-R鈉通道的激活和NaV1.8蛋白的高表達，從而增加TTX-R鈉通道的電流密度，導致腸相關DRG神經(jīng)元興奮性的增加進而參與到外周痛覺信號的調制，最終導致內(nèi)臟痛過敏。因此本研究在一定程度上揭示了功能性胃腸疾病如IB