硫化氫參與新生期結腸炎性刺激誘發(fā)成年大鼠內(nèi)臟痛的分子機制研究.pdf

1、目的：
　?。?）研究CBS調控電壓門控型鈉通道在新生期結腸炎性刺激誘導的慢性內(nèi)臟痛中的作用；
　?。?）研究去甲腎上腺素（NE）通過CBS調控辣椒素受體（TRPV1）在新生期結腸炎性刺激誘導的慢性內(nèi)臟痛中的作用；
　　方法：
　　1.對出生十天的新生期雄性大鼠在肛門處插入2cm注射0.2ml的0.5%的冰醋酸(AA)造成新生期結腸炎性刺激(NCI)從而誘導成年大鼠的結腸慢性痛過敏模型。運用腹壁撤回評分（AWR

2、score）方法評測NCI大鼠的痛行為反應。
　　2.結腸管壁注射熒光素（DiI）來標記結腸特異性背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元，運用全細胞膜片鉗方法研究NCI大鼠中腸相關DRG神經(jīng)元電壓依賴型鈉通道的變化特性。
　　3.運用ELISA試劑盒檢測NCI模型大鼠血清中去甲腎上腺素（NE）的水平。
　　4.運用Western Blotting方法檢測NCI模型大鼠腸相關DRG神經(jīng)元中CBS,鈉通道蛋白和TRPV1受體蛋白表達情況。

3、
　　結果：
　　1.NCI明顯增加大鼠對結腸擴張的過敏反應，六周時，AWR評分顯著高于對照組，這種痛覺反應持續(xù)至少三周。在第十周和第十二周時，AWR評分恢復到正常水平。
　　2.NCI增加腸相關DRG神經(jīng)元（T13-L2）電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達水平。而十周齡時NCI組和對照組的腸相關DRG神經(jīng)元電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達水平均沒有顯著差異

4、。同樣地，我們檢測了六周齡NCI組和對照組的非腸相關神經(jīng)元(L4-5)DRG，發(fā)現(xiàn)電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達水平均沒有顯著差異免疫組化三標技術顯示在DRG腸特異性神經(jīng)元中CBS和NaV1.7或NaV1.8共表達。
　　3.與對照組相比，NCI組CBS的表達水平顯著上調。CBS的拮抗劑AOAA翻轉NCI引起的大鼠內(nèi)臟痛覺反應，最優(yōu)劑量10mg/kg的藥效持續(xù)至少一個小時。并且，AOAA翻轉NCI

5、引起的腸相關DRG神經(jīng)元鈉電流密度的增加和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達水平的增加。
　　4.在最佳劑量下，非選擇性β腎上腺素受體拮抗劑，而不是α腎上腺素受體拮抗劑，明顯翻轉由HIS誘導的大鼠結腸痛過敏。進一步研究發(fā)現(xiàn)，阻斷β2腎上腺素受體明顯降低由應激導致的AWR高評分，而β1和β3腎上腺素受體拮抗劑對這種高評分沒有明顯作用。
　　5.NE參與內(nèi)臟痛敏感的形成。與對照組相比，ELISA結果顯示，NCI大鼠血清NE激素

6、水平顯著上調。但是，β2受體蛋白表達水平與對照組相比沒有明顯變化。而且，去甲腎上腺素能誘導大鼠內(nèi)臟痛過敏反應。
　　6.TRPV1表達水平上調是由NE介導的。NCI大鼠腸相關DRG神經(jīng)（T13-L2）中，TRPV1蛋白表達顯著上調。給予正常大鼠NE，腸相關DRG神經(jīng)元（T13-L2）中 TRPV1的蛋白表達水平顯著上調。給予 NCI組大鼠非選擇性腎上腺素受體β拮抗劑，顯著降低TRPV1蛋白表達水平。用細胞培養(yǎng)的方法，NE孵育正常大

7、鼠的DRG細胞，CBS表達水平顯著上調。
　　7.CBS參與NCI-TRPV1痛覺信號通路的傳遞。給予正常大鼠NE，腸相關DRG神經(jīng)元（T13-L2）中CBS的蛋白表達水平顯著上調。給予NCI組大鼠非選擇性腎上腺素受體β拮抗劑，顯著降低CBS蛋白表達水平。給予NCI組大鼠CBS拮抗劑AOAA，顯著降低TRPV1蛋白表達水平。
　　8.用細胞培養(yǎng)的方法，NE孵育正常大鼠的DRG細胞，CBS和TRPV1表達水平顯著上調。